Enzimkinetika
Az enzimes reakció sebességének leírása, jellemzőparamé- terek azonosítása. Ha:
E + S ↔ E + P
A sztöchiometriához mindegyiket mól-ban vagy grammban kellene kifejezni. De: az enzimpreparátum sohasem tiszta.
Ezért az enzimek mennyiségét a hatásuk alapján adjuk meg:
1
Enzimkinetika
Egy egység (Unit) az az enzim mennyiség, amely 1 µmol szubsztrátot alakít át vagy 1 µmol terméket képez 1 perc alattadott reakció körülmények között.
SI rendszerben: 1 Katal: 1 mol szubsztrátot alakít át 1 s alatt.
Ez hatalmas egység, praktikusabb a nanoKatal = 10-9Kat Fajlagos aktivitás: E/mg, E/ml
2
Michaelis-Menten kinetika
Kiindulási feltételezések:
k-2= 0 (a második lépés irreverzibilis) az első lépés gyorsan egyensúlyra jut = RAPID EKVILIBRIUM:
Egyensúlyi állandója:
az ES komplex stabil, az EP komplex elhanyagolható
3
k1S.E = k-1(ES)
(ES) S.E k K k
1 1
s= − =
E + S ES E + Pk1 k-1
k2
k-2
V dP dt k (ES)2
= =
(ES) E Eo = +
Michaelis-Menten kinetika
egy aktív centrum, egy szubsztrát aktivitás helyett koncentráció használható (S) >> (E0) vagyis E0/ S <<1 a „minket érdeklő” reakciósebesség:
anyagmérleg az enzimre:
4
E + S ES E + Pk1 k-1
k2 k-2
Michaelis-Menten kinetika
Osszuk el a két egyenletet:
Helyettesítsük be:
Rendezzük át:
mert volt
5
V E
k (ES) E (ES)
o
= 2
+
V E
k S K E
E S
K E
o 2
s
s
= + (ES)
S.E k K k
1 1
s = − =
S K
S K 1 S
K S E k
V
s s s o
2 = +
+
=
Vmax=k E2 o V dP dt k (ES)2
= =
V V
S K 1 S
K
max
s
s
= + V V S
K S
max s
= +
Michaelis-Menten kinetika
Ebből az sebességi egyenlet:
avagy
6
Leonor Michaelis 1875-1949 Maud Menten
1879-1960
Michaelis, L., Menten, M. (1913) Die kinetik der invertinwirkung, Biochemische Zeitung 49, 333-369
7
M és M
Briggs-Haldane kinetika
Ugyanazok a diffegyenletek, de a feltételezés: (kvázi) állandó- sult állapot =
(S) >>(E0) vagyis E0/S << 1 k1ES > k-1(ES) ill. k1ES > k2(ES)
8
E + S ES E + Pk1 k-1
k2
k-2
( )
( ) ( ) ( )
( )
1 1
1 1 2
2
dS k ES k ES dt
d ES k ES k ES k ES dt
dP k ES dt
−
−
= − +
= − −
=
d(ES)/dt =0 steady state↓
Briggs, G. E., and Haldane, J. B. (1925) A Note on the Kinetics of Enzyme Action, Bio- chem J 19, 338-339.
Briggs-Haldane kinetika
Egy rövid átmeneti szakasz (pre-steady state) után csak nagyon lassú a változás (kvázi steady state).
9
( )
dtES kE.S k( )
ES k( )
ES 0d
2 1
1 − − =
= −
Km= (k-1+ k2) / k1 E (ES) E+ = o
( )( ) ( ) (
1 2)
1 2 1 1
k k
E.S ES k
ES k k E.S k
= + +
=
−
−
Michaelis állandó
S K V S S K
S E V k
m max m
o 2
= +
= +
10
Briggs-Haldane kinetika
Michaelis -Menten Briggs-Haldane
V V S
K S
max s
= + V V S
K S
max m
= +
1 2
m 1
k k
K k
− +
=
ha (k1) >> (k2) akkor a két konstans azonos!
11
Diszkusszió
m s 2
1
K K k
= +k
s 1 1
K k k
= −
S E k S K E
V k 0 0
S
2 = ′
≈
katalitikus effektivitás = specfi(ci)tási állandó
12
S >>Ks
S <<Ks
Diszkusszió
Vmax=k2E0
derékszögű hiperbola:
V=(Vmax/Ks)S
V V S
K S
max s
= +
A M-M és B-H egyenletekben a V mindig a kezdeti reakcióse- bességet (V0→ t=0-ra extrapolált sebesség) jelenti.
13
Reakciósebesség
Linearizálások
Linearizált ábrázolást használunk, mert:
Hiperbolikus regressziót számolni gép nélkül munkaigényes Az enziminhibíciónál +információt ad.
1. Lineweaver-Burk linearizálás 1/v – 1/S
14
1 1
m1
max max
K V = V + V
⋅S
Linearizálások
2. Hanes-Langmuir linearizálás S/v – S
3. Eady-Hofstee linearizálás v/S – v
15
V
V = V max − K m S K 1
S m S
V V V
max max
= + ⋅
tg α= k2
Az enzimkoncentráció hatása
Ha vmax= k2.E0, akkor:
16
Vmax: nem maximum, hanem limit → határsebesség Nem enzimtulajdonság, mert függ E0-tól: Vmax= k2. E0 →
= AKTIVITÁS
Ak2 enzimtulajdonság = turnover number, váltásszám [s-1]→ az enzimmolekula átalakítási frekvenciája
Kiterjesztés minden enzimre és minden kinetikára:
kcat[ s-1 ]: egy enzimmolekula átalakítási frek- venciája S-telítés esetén: egy enzimmolekula időegység alatt hány molekula szubsztrátot alakít át.
Vmax= kcat. E0
A kinetikai paraméterek
17
Túl érzékeny
érzéketlen
A kinetikai paraméterek: K
s, K
maz enzim affinitása a szubsztráthoz
az élő sejtben közelítőleg ennyi az S koncentráció, mert így jól szabályozza a sebességet
Változott a KS→ Inhibitor? Aktivátor?
Enzimanalitika:
ha aktivitást mérek:
S>>KS v=vmax ha szubsztrátkoncentrá- ciót mérek:
S<<KS lineáris tartomány
18
k1 107-1010 dm3mol-1min-1[max. érték (1011) a kis molekulák diffúziósebessége
k-1 102-106min-1 k2 50-107min-1 Km 10-6- 10-2 mol/dm3
19
A kinetikai paraméterek
M 10
1s 1M
s M 10 s K 10 k
7 1 1 7 1 1 7 m cat
−
−
− −
− = =
=
k
catértékek
kcatalsó határa metabolikus en- zimeknél
Legtöbb enzim e két szélső eset között
Természetes enzimeknél: >105 Mesterséges E-nél (DNA-zyme, abzyme:<103)
20
Alap: minden enzimes reakció reverzibilis – egyensúlyra vezet.
Sokszor ez az egyensúly erősen eltolódik az egyik oldalra – pl.
a biopolimerek hidrolízisénél (amilázok, proteinázok), más- hol viszont közel 50-50%-os (például a glükóz izomeráz reak- ció)
glükóz fruktóz
Mindkét kinetikai leírásban feltételeztük, hogy a k-2= 0, ezért a reverzibilis reakciót két ellentétes egyirányú folyamat leírásá- ból állítjuk össze.
Reverzibilis reakciók
21
A két ellentétes irányú reakció egyensúlyi állandóit fölírva:
A közös elemet kiemelve:
Az eredő egyensúlyi állandót kifejezhetjük:
( )
s +1 -1
K k k
ES
= =S E
⋅
( )
+1 -2
1 2
k k
k k
S ES P
− E +
= =
+1 +2 eq(uilibrium)
1 2
P k k
K = =S k k− −
Reverzibilis reakciók
( )
p -2 2
K k k
ES
+ P E
= =
⋅
22
E + S ES E + P k1
k-1 k2
k-2
ugyanaz!
E
MI TÖRTÉNIK?
S → P vagy P → S
S
P
Itt feltételezzük az EP komplex létezését:
MIT Ő L FÜGG? K
eq, S , P értéke
Reverzibilis reakciók
?
E + S ES EP E + P k1
k-1
k2 k-2
Reverzibilis reakciók
Az eredő sebesség a két folyamat különbsége:
Vnetto= Velőre - Vvissza = k2 (ES) - k-2(EP)
Ezt az eddigiekhez hasonlóan az enzim anyagmérlegével osztjuk el:
ebből:
24
Eo= +E (ES) + (EP)
előre 2 vissza 2
o o
...
v k (ES) v k (EP)
E E (ES) (EP) ... E E
(ES) (EP)−
= =
+ + + +
0 2 0 2
E k (ES) E k (EP)
v E (ES) (EP)
− −
∆ = + +
maxs eq
ms mp
V S P V K
K 1 P S
K
∆
−
=
+ +
Reverzibilis M-M egyenlet
Reverzibilis reakciók
Behelyettesítve:
figyelembe véve, hogy:
azaz
25
s P
S P
(ES) = E (EP) = E
K ... K
max S max P
v (ES) v (EP) v E (ES) (EP)
∆ = −
+ +
max S max P
s p
s p
S P
v E v E
K K
v E S E P E
K K
−
∆ = + +
ahol azaz a
szubsztrát koncentráció eltérése az egyensúlyitól.
pedig analóg -vel, azaz P kompetitív inhibitorként viselkedik.
maxs eq
ms mp
V S P V K
K 1 P S
K
∆
−
=
+ +
Reverzibilis reakciók
26 eq
eq
P S K =
mp
1 P K
+
I
1 I K
+
(S - S )eq