A H-faktor szerepe a komplementaktiváció gátlásában és ennek összefüggése

Mivel az endotélsejtek aktivációjának és károsodásának szerepe van az aHUS patomechanizmusában, továbbá aHUS-betegekben számos H-faktor mutációt írtak le, melyek elsősorban a molekula terminális doménjeiben találhatók, vizsgáltuk, hogy mi a C-terminális domének fiziológiás szerepe, milyen kölcsönhatás játszódhat le a H-faktor és az endotélsejtek között, illetve ez hogyan magyarázhatja a mutációk összefüggését a betegséggel.

5.1.1. A H-faktor C-terminális doménjeinek szerepe a molekula endotélsejtekhez való kötődésében, és a komplementaktiváció H-faktor általi gátlása a sejtek felszínén

Ismert volt, hogy a komplementszabályozó funkciókért a H-faktor molekula N-terminális doménjei (CCP1-4) felelősek (Gordon et al., 1995; Kühn et al., 1995). Az aHUS betegekben azonosított mutációk zöme azonban meglepő módon a molekula C-terminális doménjeit érinti (Caprioli et al., 2001; Pérez-Caballero et al., 2001; Richards et al., 2001; Neumann et al., 2003). Ismert volt továbbá állatmodellekből, hogy a H-faktor hiánya a plazmában történő kontrollálatlan komplementaktivációhoz, és egy másik betegséghez, DDD-hez vezet (Høgåsen et al., 1995; Pickering et al., 2002). Mindezek miatt arra gondoltunk, hogy az aHUS esetén az endotélsejtek felszínén lehet szerepe a H-faktornak a komplementaktiváció gátlásában. Ez azonban ellentmondott annak az uralkodó felfogásnak, miszerint a H-faktor szerepe a testfolyadékokban való komplementszabályozó szerepre korlátozódik, a sejteken pedig a sejtmembránban kifejeződő komplementszabályozó molekulák gátolják a komplementaktivációt.

Elsőként a H-faktor sejtekhez való kötődését vizsgáltuk. Áramlási citofluorimetriás és mikroszkópos vizsgálatokkal sikerült kimutatnunk, hogy a tisztított H-faktor kötődik a modellként használt emberi köldökzsinórvéna eredetű endotélsejtekhez (HUVEC-hez) (I). A sejteket emberi szérumban inkubálva, majd mosva és lizálva, a szérum H-faktor kötődését is kimutattuk Western blot technikával (7. ábra). Emellett azt is bizonyítottuk, hogy a C-terminális doméneknek lényeges szerepük van a H-faktor endotélsejtekhez való kötődésében.

Ehhez a humán H-faktor ellen egy kollaborációs partnerünk (Prof. Oppermann, Göttingen) által előállított egér monoklonális antitestek kötőhelyét rekombináns H-faktor fragmentumok felhasználásával meghatároztuk (Oppermann et al., 2006). Az így már ismert kötőhelyű monoklonális antitestek jelenlétében H-faktorral inkubálva az endotélsejteket azt találtuk, hogy a C18 jelű, a H-faktor CCP20 doménjében kötődő antitest gátolta a tisztított H-faktor HUVEC-hez kötődését (8. ábra) (I). Áttekintő közleményünkben a H-faktor sejtekkel való kölcsönhatásának fontosságára hívtuk fel a figyelmet, rámutatva ennek az újonnan felismert szerepének a betegségekben, köztük elsősorban az aHUS-ban játszott valószínű szerepére.

Feltételeztük, hogy bizonyos körülmények között, a komplementrendszer túlzott aktivációjától védheti – a sejtmembránban található gátló molekulák funkcióját kiegészítve – a H-faktor a sejteket (9. ábra) (I).

A B C

1 2

7. ábra. A H-faktor kötődése endotélsejtekhez. (A) A HUVEC sejteket sejttenyésztő kamrában tenyésztettük, majd egy éjszakán át szérummentes médiumban tartottuk. Tisztított H-faktorral való inkubálást követően H-faktor specifikus poliklonális ellenanyaggal és fluoreszcens festékkel konjugált másodlagos ellenanyaggal jelöltük, fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk. (B) Tisztított H-faktor (FH) dózisfüggő kötődése HUVEC sejtekhez áramlási citofluoriméterrel mérve. Reprezentatív hisztogram. Az x-tengelyen a relatív fluoreszcencia intenzitás, az y-tengelyen pedig a sejtszám van feltüntetve. (C) Emberi szérumból kötődő H-faktor és FHL-1, valamint az FHR-1 izoformák kimutatása HUVEC sejtek lizátumából H-faktor antiszérum segítségével, Western blot technikával. A HUVEC sejteket 20% szérumban inkubáltuk, majd mostuk és lizáltuk. 1: HUVEC, 2: HUVEC + szérum. Józsi et al., Histology and Histopathology 2004, 19:251-258. (I) alapján.

8. ábra. A H-faktor a C-terminális doménjével kötődik endotélsejtekhez. HUVEC sejteket (10⁶ sejt 100 µl DPBS-ben szuszpendálva) 10 µg tisztított H-faktorral (FH) inkubáltunk, 5 µg C18 jelű monoklonális antitest jelenlétében vagy antitest nélkül. Ez az antitest a H-faktor CCP20 doménjében kötődik (Oppermann et al., 2006). A H-faktor kötődését áramlási citofluorimetriás módszerrel mértük, H-faktor specifikus poliklonális antitest és FITC-konjugált másodlagos antitesttel való inkubálás után. Reprezentatív hisztogram. Az x-tengelyen a relatív fluoreszcencia intenzitás, az y-x-tengelyen pedig a sejtszám van feltüntetve.

Józsi et al., Histology and Histopathology 2004, 19:251-258. (I) alapján.

kontroll C18 + FH FH

kontroll 1 2 5 10 µg FH

9. ábra. A sejtfelszínen kötődő H-faktor hozzájárulása az endotélsejtek aktivációtól való védelméhez. A H-faktor egyrészt a vérplazmában működik komplement-gátló fehérjeként, mivel elősegíti a képződő C3b molekulák I-faktor (FI) általi hasítását a kofaktor aktivitása révén, ezáltal csökkentve a sejteken lekötődő C3b mennyiségét. Másrészt glikán felismerő képessége révén a H-faktor hozzájárul a sejtfelszínen is a C3b enzimatikus inaktiválásához, ezáltal a felszínen zajló komplementaktiváció gátlásához. A H-faktor ugyanakkor az esetlegesen kialakuló C3bBb konvertázokat is gátolja (nincs az ábrán feltüntetve). Megjegyzendő, hogy jelenlegi ismereteink szerint a H-faktor elsősorban a sejtfelszínre rakódott C3b és glükózaminoglikánok együttesét ismeri fel CCP19-20 doménjei segítségével, tehát ekkor kötődik erősebben a sejtfelszínre. A HUVEC sejteken nem expresszálódik a CR1, ezért ez a molekula nem szerepel az ábrán, de más sejtek esetében a CR1 is gátolja a komplementaktivációt. DAF: decay accelerating factor; MCP: membrane cofactor protein. Józsi et al., Histology and Histopathology 2004, 19:251-258. (I) alapján.

Kimutattuk, hogy a H-faktor viszonylag gyengén kötődik a sejtek felszínéhez (polianionos természetű molekulákon keresztül, mint például a glükózaminoglikánok), viszont komplementaktiváció esetén a lerakódó C3b miatt fokozódik a H-faktor kötődése (10.

ábra) (II). A C-terminális doménekben kötődő antitestek nemcsak a H-faktor szérumból HUVEC-hez való kötődését, hanem immobilizált C3b-hez való kötődését is gátolták. A kontrollként használt C21 jelű antitest, ami a H-faktor CCP 15-18 doménjeiben kötődik, nem gátolta a H-faktornak sem a sejtekhez, sem a C3b-hez való kötődését. A folyadék fázisban, ahogy az várható is volt, egyik vizsgált antitest sem gátolta a H-faktornak a C3b I-faktor általi enzimatikus inaktiválását segítő képességét, azaz kofaktor aktivitását (11. ábra).

10. ábra. A H-faktor kötődése HUVEC sejtekhez. (A) HUVEC sejteket (5 × 10⁵ sejt / 50 µl) 10 µg/ml tisztított H-faktorral (FH) inkubáltunk, PBS-ben vagy 0,5x PBS-ben. A H-faktor kötődését a sejtekhez áramlási citofluoriméterrel mértük. Az ábrán a medián fluoreszcencia intenzitások (MFI) átlaga és a szórás van feltüntetve, 3 kísérlet adataiból. A hígított PBS-ben (vagyis alacsonyabb ionerejű pufferben) mérttel szemben, PBS-ben csak kismértékű H-faktor kötődést tapasztaltunk. (B) A sejteket anti-HUVEC antiszérummal előinkubáltuk, majd PBS-ben hígított, 10% normál humán szérumban való inkubálást követően a C3-fragmentumok és a H-faktor mennyiségét a megfelelő antitestek segítségével, áramlási citofluoriméterrel mértük. Az antitest-kezelés hatására jelentősen fokozódott a C3-fragmentumok lerakódása a sejteken, amivel párhuzamosan nőtt a sejtfelszínen kötődött H-faktor mennyisége is. Az ábra három mérésből a medián fluoreszcencia intenzitások (MFI) átlagát és szórását mutatja. Józsi et al., Molecular Immunology 2007, 44:2697-2706. (II) alapján.

A C3b molekula különböző részeit felismerő ellenanyagok segítségével nyomon tudtuk követni a sejtfelszínre komplementaktiváció során kovalensen kötődő C3b hasítását. A C3b hasításakor a C3d fragmentum a sejtekhez kovalensen kötődve marad, a C3c molekularész pedig lehasítódik. A C18 és az E14 antitestek jelenlétében a szérumból az endotélsejtekre kötődő C3b degradációja csökkent mértékű volt, amit a kezeletlen kontrollhoz és a C21 antitest jelenlétében inkubált sejtekhez képest nagyobb C3c/C3d arány mutatott. Ez azzal magyarázható, hogy több intakt C3b molekula maradt a C18 és az E14 jelenlétében (vagyis kevesebb, sejtekre kötődött H-faktor esetében) a sejteken (12. ábra). H-faktor depletált szérumot használva kimutattuk, hogy amennyiben visszaadjuk a H-faktort a szérumba, fokozott H-faktor kötődést és csökkent C3 és terminális komplement komplex (C5b-9) lerakódást detektálhatunk a sejteken. Normál humán szérumban, a H-faktor C-terminálisán kötődő – annak sejtekhez kötődését gátló – antitestek jelenlétében fokozott C5b-9 lerakódást mértünk a sejteken (12. ábra). Azt vizsgálandó, hogy szérumban mennyire járul hozzá a H-faktor az endotélsejteknek a komplement károsító hatása elleni védelméhez, részben leemésztettük a sejtekről a GPI-horgonyzott CD55 és CD59 komplementszabályozó molekulákat. Az így kezelt sejteket normál szérumban és H-faktor depletált szérumban

inkubálva bizonyítottuk, hogy H-faktor jelenlétében a sejtek komplement általi lízise gátolt (12. ábra) (II).

Mindezek az eredmények arra utaltak, hogy a H-faktor C-terminális doménjének vagy doménjeinek korábban alulbecsült, ám alapvetően fontos szerepe van abban, hogy a sejtekhez és más felszínekhez (pl. extracelluláris mátrix) kötődve a H-faktor hozzá tudjon járulni a komplementaktiváció megfelelő kontroll alatt tartásához. A membránkötött komplement-szabályozó fehérjék mellett tehát a H-faktor is szerepet játszhat az endotélsejtek komplement általi károsodásának megakadályozásában.

11. ábra. A faktor kötődése endotélsejtekhez és C3b-hez. (A) A kísérletekben használt H-faktor specifikus monoklonális antitestek kötőhelyei a H-H-faktor molekulán (Oppermann et al., 2006 és Józsi et al., 2007 [II] alapján). (B) H-faktor kötődése 20% normál humán szérumból HUVEC sejtekhez különböző, H-faktor specifikus monoklonális antitestek (C18, C21, E14, MH10) jelenlétében (10 µg antitest), áramlási citofluoriméterrel mérve. Az ábra a kezeletlen szérumból való H-faktor kötődés százalékában mutatja az egyes antitestek jelenlétében mért H-faktor kötődés mértékét. Öt kísérlet átlaga a szórásokkal. (C) H-faktor (2 µg/ml) kötődése ELISA-lemezeken immobilizált C3b-hez a különböző monoklonális antitestek (40 µg/ml) jelenlétében. Négy kísérlet átlaga a szórásokkal. (D) H-faktor kofaktor aktivitásának vizsgálata folyadék fázisban.C3b-t és I-faktort (1) inkubáltunk H-faktorral ellenanyag nélkül (2) és a feltüntetett antitestek jelenlétében (3-7) 10 percig 37ºC-on, majd a mintákat redukáló SDS-PAGE gélen való szeparálás és blottolás után anti-C3-mal hívtuk elő. Józsi et al., Molecular Immunology 2007, 44:2697-2706. (II) alapján.

12. ábra. A H-faktor endotélsejtekhez kötődésének funkcionális következményei. (A) HUVEC sejteket 5 percig inkubáltunk 20% humán szérumban, az ábrán jelzett H-faktor-specifikus monoklonális ellenanyagokkal (10 µg) vagy ellenanyag nélkül. A sejtekre kötődött C3b hasítódását C3c- és C3d-specifikus antitestekkel mutattuk ki áramlási citométer segítségével. Az ábra a C3c- és C3d-specifikus fluoreszcencia intenzitások arányát (C3c/C3d) mutatja, négy kísérlet átlagából, a szórások feltüntetésével. (B) HUVEC sejteket 10% H-faktor-depletált szérummal (FH-depl. NHS) inkubáltunk. Párhuzamos kísérletekben visszaadtuk a szérumba a H-faktort (fekete oszlopok). Az ábra a sejteken kötődött H-faktort (FH), C3-fragmentumokat és membránkárosító komplexet (MAC; C5b-9) mutatja. MFI:

medián fluoreszcencia intenzitás. Négy kísérlet átlaga a szórásokkal. (C) A sejteken 20%

szérumból lerakódó C5b-9 terminális komplex kimutatása a különböző H-faktor specifikus antitestek (mAb) jelenlétében, C5b-9 specifikus ellenanyaggal, áramlási citofluorimetriával.

EDTA: 20 mM EDTA-t tartalmazó szérummal inkubált sejteken mért fluoreszcencia jel.

Négy kísérlet átlaga a szórásokkal. (D) HUVEC sejteket 10% H-faktor depletált humán plazmában inkubálva, az alternatív út aktivációját lehetővé tevő Mg²⁺ ionok jelenlétében, csak kismértékű sejtlízist tapasztaltunk, amit a felülúszóban az előzőleg fluoreszcens festékkel feltöltött sejtekből kiszabaduló kalcein segítségével mutattunk ki. Amennyiben enzimatikus kezeléssel (PI-PLCγ segítségével) eltávolítottuk a sejtmembránról a GPI-horgonyzott CD55 és CD59 komplementszabályozó molekulák jelentős részét, fokozott sejtlízist mértünk. A H-faktor depletált plazmába a H-H-faktort visszaadva, a CD55 és CD59 molekulák hiánya ellenére is jelentősen csökkent sejtlízis volt mérhető. Négy kísérlet átlaga a szórásokkal. AFU:

artificial fluorescence unit; n.d.: not determined. Józsi et al., Molecular Immunology 2007, 44:2697-2706. (II) alapján.

Eredményeinket további vizsgálatokban mi is (Jokiranta et al., 2005; Oppermann et al., 2006) és más munkacsoportok is megerősítették. Saját publikációnkkal egyidőben egy spanyol kutatócsoport szintén kimutatta a H-faktor szerepét a sejtek védelmében. Hemolitikus teszttel igazolták, hogy C-terminális H-faktor mutációt hordozó aHUS betegek szérumában a birka vörösvérsejtek lízise figyelhető meg (Sánchez-Corral et al., 2004). Később amerikai kutatók is kimutatták, hogy a H-faktor a C-terminális doménjeivel tud vörösvérsejtekhez kötődni. Ők a H-faktor rekombináns C-terminális fragmentumát (CCP19-20) használták kompetíciós kísérletekben, és azt találták, hogy a rekombináns CCP19-20 a szérumba adva dózisfüggően fokozza birka vörösvérsejtek lízisét, valamint emberi vörösvértestek lízisét is, amennyiben előzetesen a CD55 és CD59 membránkötött komplementgátló fehérjéket ellenanyagokkal blokkolják (Ferreira et al., 2006).

A saját vizsgálatainkat mindazonáltal lényegesnek gondolom abból a szempontból is, hogy endotélsejteken zajlottak, így in vitro bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy a H-faktor hozzájárul a sejtek védelméhez, feltehetően a veseendotél esetében is. A H-faktor kölcsönhatása különböző sejtekkel és más felszínekkel azóta már szélesebb körben elfogadott, mi is és mások is vizsgálták például apoptotikus sejtekhez és az extracelluláris mátrixhoz való kötődésének funkcionális jelentőségét (Trouw et al., 2007; Mihlan et al., 2009; Kopp et al., 2012; Banda et al., 2013).

5.1.2. H-faktor mutációk funkcionális vizsgálata

A H-faktor aHUS-ban játszott szerepének vizsgálata során a betegekben leírt mutációinak a funkcionális következményeit is tanulmányoztuk. Mivel a H-faktor CCP 19-20 doménjeit aHUS esetében mutációs „hot spot”-ként azonosították, az ezeket a doméneket lefedő átfedő peptidek segítségével vizsgáltuk egyes ligandumok, így a heparin mint polianion, valamint a C3b és a C3d mint komplement ligandumok kötődését. A peptideket hordozó membránokat a különböző ligandumok oldatában való inkubálás után megfelelő reagensekkel előhívtuk. Az eredmények alapján több ligandumkötő régiót azonosítottunk, melyek részben azonosak voltak a heparin, C3b és C3d esetében is (13. ábra) (III). Ezt az magyarázza, hogy ezek a kötőhelyek a CCP domének felszínén levő hurok régiók területére esnek. A mutációk egy része ezekben a felszíni aminosavakban található, más részük a domén belsejében, és a doménszerkezetet befolyásolhatják.

A

B

C

13. ábra. Lineáris ligandumkötő motívumok azonosítása a H-faktor C-terminális doménjeiben. (A) A H-faktor CCP19 és CCP20 doménjeit lefedő, 13 aminosav hosszúságú, 10 aminosavnyi átfedést tartalmazó peptideket szintetizáltattunk nitrocellulóz membránon. A membránokat jelölt heparinnal, tisztított humán C3b-vel és C3d-vel inkubáltuk; ez utóbbiak kötődését antitestek segítségével detektáltuk. Az így azonosított kötőhelyeket keretezés jelöli.

(B) Egyes, aHUS-ban leírt mutációk, ezek közül a kísérleteinkben vizsgált aminosavak (pirossal karikázva) és a peptid scan segítségével azonosított, C3b-kötésben részt vevő aminosavak (zöld háttérrel kiemelve) helyzete a H-faktor CCP19 és CCP20 doménjeiben. (C) Ugyanezek az aminosavak a domének térbeli modelljén mutatva. A rózsaszínnel jelzett aminosavak nem a domén felszínén találhatók. Józsi et al., Journal of the American Society of Nephrology 2006, 17:170-177. (III) alapján.

Az aHUS-ban leírt C-terminális mutációk (W1157R, W1183L, V1197A, R1210C, R1215G és P1226S) vizsgálatához a H-faktor CCP8-20 fragmentumát (FH 8-20) és annak mutagenezissel előállított változatait expresszáltuk. A rekombináns mutáns fehérjéket affinitás kromatográfiával vizsgálva azt találtuk, hogy azok különböző mértékben, de csökkent kötődést mutattak heparinhoz, valamint mikroszkóppal vizsgálva az endotélsejtekhez is. A vizsgált mutánsok közül a W1157R mutatta a legkisebb funkciókárosodást a heparinhoz és HUVEC-hez való kötődésben, ugyanakkor ez a mutáns (a P1226S-sel együtt) a többihez képest gyengébben kötődött C3b-hez és C3d-hez is (14. ábra és 4. táblázat) (III).

A

B

14. ábra. Egyes aHUS-ban leírt H-faktor mutációk funkcionális jellemzése. (A) A mutáns fehérjék a vad típusú H-faktorhoz (WT) képest gyengébb C3b kötődést mutatnak felületi plazmon rezonancia vizsgálatban. (B) Vad típusú és mutáns H-faktor CCP8-20 fragmentumok kötődése HUVEC-hez, mikroszkópos vizsgálattal. Zöld szín: H-faktor (poliklonális antitest és Alexa 488-cal konjugált másodlagos antitesttel festve), kék szín: DAPI sejtmag festés. Józsi et al., Journal of the American Society of Nephrology 2006, 17:170-177. (III) alapján.

4. táblázat. A vizsgált H-faktor mutánsok heparinhoz, C3b-hez, C3d-hez és HUVEC sejtekhez való kötődési jellemzőinek összegzése.

H-faktor mutáns heparin C3b C3d endotélsejt

FH 8-20/W1157R ++ (+) (+) ++

FH 8-20/W1183L + + + +

FH 8-20/V1197A (+) + + (+)

FH 8-20/R1210C + + + +

FH 8-20/R1215G + + + +

FH 8-20/P1226S (+) (+) (+) n.d.

FH 8-20 vad típusú +++ +++ +++ +++

A kötődés erősségét a + jelek száma jelzi; n.d.: nem volt meghatározva. Józsi et al., Journal of the American Society of Nephrology 2006, 17:170-177. (III) alapján.

További H-faktor mutációk más munkacsoportok és saját munkacsoportunk általi jellemzése is hasonló eredményekre vezetett (Manuelian et al., 2003; Heinen et al. 2007;

Sánchez-Corral et al., 2002).

Az egyik, aHUS-ban leírt H-faktor mutáció korai stop kodont eredményez (E1172Stop), ezáltal a mutáns fehérjének gyakorlatilag hiányzik a CCP20 doménje. A beteg plazmájából el lehetett különíteni a mutáns molekulát, mivel jóval gyengébben kötődött heparinhoz. A tisztított, mutáns H-faktor csökkent mértékű kötődést mutatott C3b-hez, C3d-hez és endotélsejtekC3d-hez is, és emiatt a sejtfelszíni kofaktor aktivitása is lényegesen gyengébb volt (Manuelian et al., 2003; Heinen et al., 2007).

Egy másik érdekes mutáció az R1210C, ami a beteg szérumában Western blot vizsgálattal kisebb mobilitású fehérjecsíkként azonosítható. Ennek az a magyarázata, hogy a cisztein oldallánc révén a szérum albuminhoz kovalensen kötődik a mutáns molekula. Ennek következtében a mutáns H-faktor sztérikus okok miatt nem tud a ligandumaihoz kötődni (Sánchez-Corral et al., 2002; Recalde et al., 2016).

Két munkacsoport részletesen vizsgálta a H-faktor heparin- és C3b-kötő helyeit, ami megerősítette a C-terminális domének döntő szerepét ezekben a kölcsönhatásokban (Schmidt et al., 2008; Ferreira et al., 2009). Ferreira és munkatársai azt találták, hogy egyes mutációk még növelhetik is a H-faktor heparinhoz vagy C3b-hez való kötődésének erősségét;

ugyanakkor a fiziológiás helyzethez közelebb álló sejtes (hemolízis) esszében a mutáns fehérjék kevésbé tudták leszorítani a natív H-faktort a sejtekről. Ebből arra következtettek, hogy valójában a sejtfelszíni polianionos jellegű molekulák és a sejtekre kötődött C3b együttesének felismerése teszi lehetővé, hogy a H-faktor a sejtekhez kötődve kifejtse komplementgátló hatását (Ferreira et al., 2009).

A C-terminális domének (FH19-20) és a C3d komplexének szerkezetét két csoport is meghatározta (Kajander et al., 2011; Morgan et al., 2011). Ezek egyrészt megerősítették a korábbi eredményeket, miszerint a H-faktor a komplementrendszer aktiválódása során sejtfelszínre lekötődött C3b-hez, vagy annak C3d fragmentumához úgy tud kötődni, hogy egyidejűleg a saját sejteken megjelenő polianionos molekulákhoz is kötődik. Ez a kettős felismerés biztosítja a saját és nem-saját H-faktor általi megkülönböztetését. Másrészt az adatok az egyes aHUS-asszociált H-faktor mutációk hatását is megmagyarázzák.

A heparin ugyanakkor nem feltétlenül jó modell minden mutáció esetében, hiszen más polianionos jellegű molekulák is fontosak lehetnek a H-faktor kötődésében, sőt, valószínűsíthetően más glükózaminoglikánokon keresztül kötődik a H-faktor a sejtek felszínére. Kollaboráció keretében részletesen jellemeztük a H-faktor C-terminálisán található glükózaminoglikán-kötő hely szerepét az endotélsejtekhez való kötődésben (Jokiranta et al., 2005). Egy nemrég publikált tanulmányban a H-faktor sziálsavval való kölcsönhatását vizsgálták részletesebben, és kimutatták, hogy az aHUS-ban leírt H-faktor mutációk egy része a sziálsav-kötő helyet érinti (Blaum et al., 2015).

Összefoglalva elmondhatjuk, hogy a C-terminális doménekben létrejött mutációk következtében megváltozik a H-faktor sejtfelszíni polianionos molekulákkal és/vagy a lekötődött C3b-vel, vagy annak C3d fragmentumával való kölcsönhatásának természete. Ez a sejtek felszínén csökkent H-faktor aktivitást eredményez, ami megmagyarázhatja ezen mutációk szerepét a betegség kialakulásában. A H-faktor túl erős kötődése, amely egyes mutánsok esetében megfigyelhető, ugyanúgy a komplementszabályozás zavarához vezet, mint a gyakrabban megfigyelhető gyengébb kötődés a komplement támadás alatt álló sejtek felszínén (Lehtinen et al., 2009; Kajander et al., 2011).

5.2. H-faktor ellenes autoantitestek funkcionális jellemzése

Időközben egy francia kutatócsoport 48, aHUS-ban szenvedő gyermek szérumát vizsgálva három betegben kimutatta H-faktor ellenes autoantitestek jelenlétét (Dragon-Durey et al., 2005). Az előzőekben ismertetett eredményeink alapján felmerült a kérdés, hogy az autoantitestek a mutációkhoz hasonló módon befolyásolják-e a H-faktor funkcióját. Ennek megválaszolásához a H-faktor ellenes autoantitestek mérésére adaptáltuk a Dragon-Durey és munkatársai által leírt ELISA módszert, aminek a segítségével kezdetben német betegek szérum mintáinak szűrését végeztük el. A 60 beteg közül 51 aHUS beteg volt, míg 9 ún. D+

HUS beteg (a gyakoribb, bakteriális fertőzés következtében kialakuló betegség). A vizsgált betegek között 5 olyan aHUS beteget azonosítottunk, akiknél az elvégzett genetikai vizsgálat során nem találtak komplementgén-mutációt, szérumuk viszont erős specifikus reaktivitást mutatott a mikrotiter lemezeken immobilizált tisztított H-faktorral. Rekombináns H-faktor fragmentumok felhasználásával megállapítottuk, hogy mind az öt beteg autoantitestjei a H-faktor C-terminális CCP 19-20 doménjeihez kötődnek, amit ismert kötőhelyű monoklonális antitestek (Oppermann et al., 2006; Józsi et al., 2007 [II]) segítségével is megerősítettünk (15. ábra) (IV). Az autoantitestek kötődése H-faktorhoz ugyancsak gátolható volt a C-terminális domének ellen termeltetett poliklonális ellenanyaggal, míg az N-C-terminális domének elleni poliklonális antitest nem mutatott gátló hatást (15. ábra).

A betegek szérumából tisztított IgG a H-faktor C3b-hez való kötődését gátolta.

Kimutattuk továbbá, hogy a vizsgált betegek szérumában a normál szérumokkal ellentétben feloldódtak a birka vörösvérsejtek; ez tisztított H-faktor feleslegben adásával gátolható volt (16. ábra) (IV). Ezekkel az adatokkal elsőként bizonyítottuk, hogy az aHUS betegekben előforduló faktor ellenes autoantitestek az aHUS-asszociált mutációkhoz hasonlóan, a H-faktor sejtekhez kötődését akadályozva fogékonyabbá teszik a sejteket a komplement általi károsító hatásra.

15. ábra. Az aHUS-betegekben azonosított H-faktor autoantitestek a molekula C-terminális doménjeihez kötődnek. (A) 5 aHUS beteg szérumából autoantitestek kötődése immobilizált rekombináns H-faktor fragmentumokhoz (CCP1-7, CCP8-11, stb.) és BSA valamint H-faktor (FH) negatív, illetve pozitív kontroll fehérjékhez (ELISA). Az autoantitesteket tormaperoxidázzal konjugált anti-humán IgG segítségével detektáltuk. NHS: normál humán szérum (egészséges kontroll). Három kísérlet egyikének eredményét mutatja a reprezentatív ábra. (B) A H-faktor CCP19-20 doménjei ellen termelt poliklonális ellenanyag (anti-FH19-20) gátolja az autoantitestek kötődését H-faktorhoz, hasonlóan a teljes molekula ellen termeltetett poliklonális ellenanyaghoz (anti-FH). Az N-terminális domének elleni (anti-FH1-4) és komplement C3 elleni (anti-C3) poliklonális antitestek mellett az antitestet nem tartalmazó puffer (PBS) esetében kapotthoz hasonló kötődést tapasztaltunk. Az ábra az egyik beteg (#564) szérumával kapott eredményeket mutatja. Három kísérlet átlaga a szórásokkal.

(C) A vizsgált H-faktor specifikus monoklonális antitestek közül a C-terminálisan kötődő C02, C14 és C18 jelű antitestek gátolták az autoantitestek H-faktorhoz kötődését. Három kísérlet egyikének eredményét mutatja a reprezentatív ábra. (D) A kísérletekben használt, humán H-faktor specifikus egér monoklonális antitestek kötőhelyei. Józsi et al., Blood 2007, 110:1516-1518. (IV) alapján.

16. ábra. Az aHUS-asszociált H-faktor autoantitest gátolja a molekula C-terminálisának

16. ábra. Az aHUS-asszociált H-faktor autoantitest gátolja a molekula C-terminálisának