Az egyes felhasznált anyagok és módszerek részletes leírása a saját közleményekben található meg, itt csak egyes általánosabb és speciális anyagokat, valamint az alkalmazott fontosabb módszereket sorolom fel. Zárójelben, római számokkal feltüntettem az egyes módszereket tartalmazó saját publikációimat (ld. 7.1. fejezet).
Komplement fehérjék
A kísérletek során felhasznált speciális komplement kötődési és aktivitási esszékben a legtöbb esetben kereskedelmi forgalomban kapható, tisztított komplement fehérjéket használtunk. Az emberi szérumból tisztított H-faktor, C3, C3b, iC3b, C3d, B-faktor, D-faktor, P-faktor (properdin), I-faktor, C1q, rekombináns CRP általában a Merck (Darmstadt, Németország), illetve a Complement Technologies (Tyler, Texas, USA) cégektől került beszerzésre.
Rekombináns fehérjék előállítása
A H-faktor fragmentumok, mutánsok és FHR fehérjék klónozásához és expressziójához PCR és irányított mutagenezis technikákat használtunk (III-V, VII-IX, XI-XV, XIX). A felhasznált primerek, körülmények és DNS-konstrukciók leírása az egyes publikációkban részletesen leírva megtalálhatók. Egyes esetekben (FHL-1, FHR-1, FHR-4B, FH CCP1-4, CCP1-7, CCP8-14, CCP15-20, mini H-faktor) kodon-optimalizált szekvenciákat szintetizáltattunk (GenScript, Piscataway, NJ, USA) (XII, XV, XIX). Az irányított mutagenezist a QuikChange II XL site-directed mutagenesis kit (Stratagene, Amsterdam, Hollandia) segítségével végeztük (III, XII, XV). A fehérje expresszióhoz a pBSV-8His bakulovírus vektort használtuk (Kühn and Zipfel, 1995). A kísérletekhez Sf9 rovarsejtekben expresszáltunk rekombináns H-faktor fragmentumokat, FHR fehérjéket és azok fragmentumait (II-IX, XII-XVII, XIX-XX). A hisztidin-címkével ellátott fehérjék tisztítása nikkel-affinitás kromatográfia segítségével történt. A megfelelő pufferbe dializált, tisztított fehérjéket gélben ezüstfestéssel, valamint Western blot technikával is ellenőriztük.
Antitestek
A specifikus komplement komponensek kimutatására általában a kereskedelemben kapható, ismert specificitású és jól jellemzett poliklonális és monoklonális elleanyagokat használtunk.
Így a H-faktor, C3b, C3d, iC3b, B-faktor, properdin, CRP, PTX3, C1q ellenes ellenanyagokat az egyes cikkekben megjelölt cégektől és forgalmazóktól szereztük be (Merck; Dako; R&D System; MP Biomedicals; Quidel; Sigma-Aldrich). Egyes ellenanyagokat (köztük számos, humán H-faktor ellenes egér monoklonális ellenanyagot) kollaborációs partnereink bocsátottak rendelkezésre (I, II, IV-VI). FHR-4 ellenes nyúl ellenanyagot az általunk expresszált és tisztított, rekombináns FHR-4A CCP2-4 fehérje – melyről a hisztidin-címkét enterokináz segítségével eltávolítottuk – felhasználásával a BioGenes (Berlin, Németország) állította számunkra elő (XII). Az egyes másodlagos, torma peroxidázzal vagy fluoreszcens festékekkel konjugált ellenanyagokat különböző gyártóktól szereztük be; ezek az egyes közleményekben jelezve vannak.
Specifikus komplement aktivációs termékek (C3a, C5a, SC5b-9) kimutatására kereskedelmi forgalomban kapható ELISA kiteket használtunk (Quidel, San Diego, USA).
Pufferek
Az egyes biokémiai, molekuláris biológiai és immunológiai alapmódszerek esetében a szokásos puffereket használtuk (Erdei A, 2006), ezek egy részét (pl. DPBS Ca2+ és Mg2+
nélkül, DPBS-EDTA stb.) különböző cégektől szereztük be (ezek a publikációkban fel vannak tüntetve). Speciális vizsgálatokhoz, például a C3bBb konvertáz in vitro felépítéséhez, komplement aktiváció méréséhez használt pufferek részletes összetételét és az alkalmazott körülményeket az egyes publikációk tartalmazzák (II, IV, V, XII-XVII, XIX, XX).
Sejtek
A munkáinkban felhasznált sejtvonalakat az ATCC-től szereztük be (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA).
Az emberi köldökvéna endotélsejtek (HUVEC) tenyésztésére DMEM médiumot használtunk, amely 10% FCS-t, penicillint (100 U/ml), streptomycint (100 μg/ml), Fungizone-t (250 ng/ml) és L-glutamint tartalmazott. A sejteket 5% CO2-t és megfelelő páratartalmat biztosító inkubátorban 37ºC-on tenyésztettük (I-III).
Egyes esetekben a HUVEC sejtek által termelt extracelluláris mátrixot használtuk fel fehérjék kötődésének kimutatására és komplementaktiváció mérésére. Ennek során 10 mM EDTA tartalmú DPBS-sel inkubálva távolítottuk el a sejteket, majd az extracelluláris mátrixot tartalmazó sejttenyésztő lemezt használtuk a vizsgálatokhoz (XV, XVII).
A Jurkat, Raji, U937, THP-1 sejteket 10% FCS-t, penicillint, streptomycint és L-glutamint tartalmazó RPMI-1640 médiumban tenyésztettük 37ºC-on, 5% CO2 és megfelelő páratartalom mellett. Apoptózist staurosporin kezelés segítségével, nekrózist hőkezeléssel váltottunk ki (XIII). Az apoptózis és nekrózis ellenőrzésére Annexin-V és propidium jodiddal történő festést, és az áramlási citofluorimetria módszerét használtuk.
A birka és nyúl vörösvérsejteket kereskedelmi forrásból szereztük be. A vörösvérsejteket Alsever-oldatban tároltuk, a kísérleteknél a megfelelő pufferben mostuk és szuszpendáltuk fel őket (IV, V, VII, XIX).
A H-faktor és az FHR fehérjék szérumból való kötődését, valamint a rekombináns vad típusú és mutáns fehérjék sejtekhez (HUVEC, apoptotikus és nekrotikus Jurkat sejtek, birka vörösvérsejtek) kötődését áramlási citometria, Western blot és mikroszkópos vizsgálatok segítségével végeztük (I-III, VII, XIII).
Fehérje kölcsönhatások és funkcionális vizsgálatok
A módszerek általános leírásai megtalálhatók az egyetemi tankönyvekben, jegyzetekben, szakkönyvekben, és a szakterületemen általánosan ismertek, ezért azokat nem tartom szükségesnek itt ismertetni. Mivel adott módszer esetében is különböző körülmények és reagensek alkalmazásával történtek a kísérletek, ezek leírása meghaladná az értekezés kereteit. Az egyes speciális ELISA, Western blot, mikroszkópos és áramlási citofluorimetriás kísérletek részletes leírása megtalálható a hivatkozott közleményekben. Az alábbiakban csak röviden felsorolom a végzett főbb vizsgálatokat.
Kofaktor aktivitást és konvertáz lebomlást gyorsító aktivitást Western blot és ELISA segítségével mértünk (II, XII, XIX).
Fehérje kölcsönhatásokat ELISA, felszíni plazmon rezonancia és Western blot segítségével vizsgáltunk (II-IV, VII-IX, XII-XV, XVII, XVIII). Ligandum kötőhelyek meghatározásához membránon immobilizált átfedő peptidsorozatokat és mutagenezis vizsgálatokat végeztünk (III, XII, XIV, XV).
A H-faktor autoantitesteket ELISA módszerrel detektáltuk; az autoantitestek kötőhelyének meghatározásához rekombináns fehérje fragmentumokat és mutáns fehérjéket használtunk (IV-IX, XV). Szérumok hemolitikus hatását birka és nyúl vörösvérsejtek segítségével mértük (IV, V, VII, XIX, XX). Az immunkomplexeket ELISA és Western blot, az antitestek aviditását ELISA segítségével mértük (V, VII-IX).
Komplementaktivációt ELISA (C3, C4, C5b-9 lerakódás), birka vörösvérsejtek lízise (a kiszabaduló hemoglobin mérésével), sejteken pedig áramlási citometria és Western blot segítségével vizsgáltunk (II, XII-XIV, XVI, XVII, XIX, XX).
Statisztikai analízis
Az adatok értékelésére, az egyes kezelések során kapott különbségek szignifikanciájának meghatározására a megfelelő statisztikákat alkalmaztuk, GraphPad Prism program segítségével (GraphPad Software, San Diego, CA). A p < 0,05 értékeket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak.
Ábrák szerkesztése
Az adatokból a GraphPad Prism vagy Excel programok segítségével készítettük el a grafikonokat. A képként exportált grafikonok, mikroszkópos felvételek, beszkennelt gél- és Western blot képek további szerkesztését, feliratozását, ábrákba rendezését, valamint a rajzokat a Paint, Adobe Photoshop és CorelDraw programok segítségével végeztük, illetve készítettük el.