Az FHR molekulák funkciója - Eredmények és megbeszélésük

5. Eredmények és megbeszélésük

5.3. Az FHR molekulák funkciója

Az FHR fehérjék léte 1990 óta ismert volt. A H-faktorral való szerkezeti hasonlóság miatt egyesek „kis H-faktoroknak”, azaz a komplementaktivációt gátló, a H-faktorral azonos funkciójú molekuláknak (Zipfel and Skerka, 1994), míg mások a komplementszabályozó CCP 1-4 doménekkel homológ domének hiánya miatt a komplementaktiváció szempontjából jelentéktelen fehérjéknek tartották őket. Kismértékű kofaktor aktivitást leírtak az FHR-3, FHR-4 és FHR-5 molekulákról is (Hellwage et al., 1999; McRae et al., 2005), bár ezek nagy, minden valószínűség szerint nem fiziológiás koncentrációkat igényeltek ezekből a fehérjékből.

Genetikai vizsgálatok alapján azonban kiderült, hogy az FHR fehérjék szerepét alábecsülték, és nem valószínű, hogy csak élettanilag jelentéktelen evolúciós melléktermékek lennének. Mind a H-faktorról, mind az FHR-ekről igazolták elsősorban egyes vesebetegségekkel és az időskori makuladegenerációval való kapcsolatukat. A fehérjék domén-szerkezete és az addigi adatok alapján három fő lehetőséget vázoltunk fel az FHR-ek

szerepére: (1) a faktort segítő, szinergisztikus, komplementaktivációt gátló hatást, (2) a H-faktorral antagonista hatást, és (3) a H-faktorétól független komplementszabályozó vagy más funkciót (32. ábra) (X). A funkciójuk tisztázása és betegségekben játszott szerepük megértése céljából egyes FHR fehérjéket előállítottunk rekombináns DNS-technika és rovarsejtekben való expresszió útján. Vizsgáltuk a H-faktor ismert ligandumaival való kölcsönhatásukat:

C3b-vel, a gyulladásos folyamatokban szerepet játszó pentraxinokkal (C-reaktív fehérje és pentraxin 3), valamint az extracelluláris mátrixszal, és tanulmányoztuk a H-faktor kötődését és aktivitását befolyásoló képességüket.

32. ábra. A H-faktorral rokon fehérjék feltételezett szerepe. (A) A H-faktorhoz hasonló, azzal szinergisztikus komplementszabályozó (a komplementaktivációt gátló) funkció. Erre példa az FHR-3 fehérje, melyről leírták a H-faktor kofaktor aktivitását fokozó hatását (Hellwage et al., 1999). (B) Kompetíció a H-faktorral, ezáltal a H-faktor komplementgátló funkciójának gátlása. Erre példa az FHR-1 fehérjére leírt kompetíció (de-reguláció), mely ezáltal fokozza a komplementaktivációt (Goicoechea de Jorge et al., 2013). (C) A H-faktorétól független komplementgátló funkció (pl. FHR-5 esetében leírt gyenge kofaktor aktivitás [McRae et al., 2005]), vagy egyéb, akár komplementaktiváló képesség (lásd pl. általunk az FHR-4 és FHR-5 esetében később leírt alternatív utat aktiváló képességet [Hebecker and Józsi, 2012; Csincsi et al., 2015], de elképzelhető a komplementrendszeren kívül eső funkció is. Józsi and Zipfel, Trends in Immunology 2008, 29:380-387. (X) alapján.

5.3.1. Az FHR-4A molekula és funkciójának vizsgálata

Célunk volt annak megállapítása, hogy léteznek-e még korábban ismeretlen, H-faktorral rokon molekulák (megjegyzendő, hogy az emberi géntérkép vizsgálataink kezdetén még nem volt ismert). Mivel az ismert FHR fehérjék mindegyike a májban expresszálódik, emberi máj expressziós fág könyvtár szűrését végeztük el, H-faktor és már ismert FHR alapú, radioaktívan jelzett próbák segítségével. Ennek során sikerült izolálni egy olyan klónt, amelynek szekvenciája a korábban leírt FHR-4 molekulára nagymértékben hasonlított. Ez az FHR-4 molekula hosszú izoformája (FHR-4A), amely 9 CCP doménből áll, és gyakorlatilag tartalmazza a rövidebb, FHR-4B-nek elnevezett izoforma doménjeit, illetve négy, duplikáció útján létrejött extra domént (33.A ábra). Az FHR-4 fehérjére vonatkozó korábbi irodalmi adatok, illetve saját Western blot vizsgálatok is megerősítették az „új” izoforma létezését.

Szérumban ugyanis egy kb. 86-kDa molekulatömegű glikoprotein azonosítható FHR-4 antiszérummal, amely deglikoziláció után jó egyezést mutat a szekvencia alapján jósolt molekulatömeggel. A korábban elvégzett fehérjeanalízisből származó peptidek pedig teljes egyezést mutattak a jósolt aminosav-szekvenciával. A szérumban domináns izoformaként azonosítottuk az FHR-4A-nak elnevezett molekulát (33.B ábra) (XI).

33. ábra. Az FHR-4A molekula. (A) Az újonnan leírt, FHR-4A-nak elnevezett, H-faktorral rokon fehérje 9 CCP doménből épül fel, melyek a H-faktor CCP6, CCP8, CCP9, CCP19 és CCP20 doménjeivel homológok. Az FHR-4B doménjein (fekete domének) kívül intramolekuláris duplikáció révén létrejött további 4 domént tartalmaz (fehér domének). (B) Az FHR-4A molekula egy kb. 86-kDa molekulatömegű glikoproteinként azonosítható a vérplazmában. A kísérlet során 1 µl plazmát nem-redukáló körülmények között futtattunk 10%-os SDS-poliakrilamid gélen. A nitrocellulóz membránra blottolt fehérjéket a rekombináns FHR-4B ellen előállított nyúl antiszérum segítségével detektáltuk. Józsi et al., European Journal of Human Genetics 2005, 13:321-329. (XI) alapján.

Az FHR-4 mindkét izoformáját előállítottuk rekombináns fehérje formájában. A komplementaktivációban játszott szerepének vizsgálatához a C3b-vel, valamint az egyik fő akut fázis fehérjével, a gyulladás és fertőzés során a szérumban nagy koncentrációban megjelenő C-reaktív fehérjével (CRP) való kölcsönhatását, és ezek funkcionális jelentőségét vizsgáltuk. A korábbi adatokkal megegyezően nem sikerült fiziológiásan releváns FHR-4 koncentrációt használva kofaktor aktivitást kimutatni. A C3b az FHR-4A és FHR-4B C-terminális doménjeiben kötődött, melyekkel homológ domének a H-faktorban is kötnek C3b-t (34.A ábra). Ugyanakkor eredményeink szerint az FHR-4-hez kötődő C3b molekulához kötődni tud a B-faktor, és D-faktor jelenlétében aktív C3bBb konvertáz alakul ki. In vitro körülmények között az FHR-4 szérumban képes volt aktiválni az alternatív utat, amit a C3 depozíció fokozódásával, valamint a kialakuló konvertáz komponenseinek (C3b, Bb és properdin) kimutatásával igazoltunk (34.B ábra). Az alternatív út C3bBb konvertázának felépülését az FHR-4-en tisztított fehérjék segítségével is bizonyítottuk. Az ELISA lemezen, az immobilizált FHR-4-gyel fedett felszínen felépült konvertáz aktivitását C3 hozzáadásával, és a felülúszóban a képződött C3a mérésével mutattuk ki (35. ábra). Mutáns fehérjék előállításával és vizsgálatával igazoltuk a specifikus C3b-kötés szerepét az FHR-4 által kiváltott alternatív út aktivációban (36. és 37. ábra). Ezáltal elsőként sikerült kimutatnunk egy FHR molekuláról, hogy a H-faktorral ellentétben fokozza a komplementaktivációt (XII).

34. ábra. A C3b az FHR-4 C-terminális doménjeihez kötődve lehetővé teszi az alternatív út aktivációját. (A) Az FHR-4 két izoformáját és a teljes FHR-4A-t lefedő rekombináns fragmentumokat 250 nM koncentrációban immobilizáltuk. 25 µg/ml C3b kötődését anti-humán C3 antitest segítségével detektáltuk. Az ábra három kísérlet átlagát mutatja a szórásokkal. (B) Az ábrán feltüntetett fehérjéket 100 nM koncentrációban immobilizáltuk, majd mosás és blokkolás után 37ºC-on 30 percig 5% normál humán szérummal inkubáltuk Mg²⁺/EGTA tartalmú pufferben. A C3b, a B-faktor (FB) és a properdin kötődését specifikus antitestekkel detektáltuk. Az ábra három kísérlet átlagát mutatja a szórásokkal. Hebecker and Józsi, Journal of Biological Chemistry 2012, 287:19528-19536. (XII) alapján.

35. ábra. A C3bBb konvertáz felépülése FHR-4-en. (A) A rekombináns FHR-4A, FHR-4A CCP1-3 és FHR-4A CCP4-9 fehérjékkel (100 nM) fedett ELISA lemezeket C3b-vel inkubáltuk (30 min, 37°C), majd a nem kötődött C3b kimosása után B-faktort (FB), D-faktort (FD) és properdint (FP) adtunk hozzá (1 óra 37°C-on). Mosás után a lemezen felépült konvertázt poliklonális anti-FB ellenanyaggal detektáltuk. Az ábra két párhuzamos méréssel végzett két kísérlet adatainak átlagát mutatja a szórásokkal. (B) Az előzőek szerint előállított, FHR-4A-C3bBb konvertázt, illetve kontrollként immobilizált C3b-n felépült konvertázt 10 µg/ml C3-mal vagy pufferrel inkubáltunk (1 óra 37°C-on), majd a felülúszóból C3a ELISA kit segítségével mértük a képződött C3a-t. Az ábra két párhuzamos méréssel végzett két kísérlet adatainak átlagát mutatja a szórásokkal. Hebecker and Józsi, Journal of Biological Chemistry 2012, 287:19528-19536. (XII) alapján.

36. ábra. A H-faktor CCP19 és CCP20 doménjeivel homológ FHR domének aminosav-szekvenciáinak összehasonlítása. A H-faktorban a C3b/C3d kötésében kritikus szerepet játszó aminosavak közül a CCP19-ben lévő kötőhellyel szemben a CCP20 C3b/C3d-kötő helyének fontos aminosavai – az FHR-1 kivételével – nem konzerváltak az FHR fehérjékben. Ez alapján az FHR-4-ben csak a CCP19-beli C3b/C3d-kötő hely őrződött meg. Az általunk előállított FHR-4 mutációk helyét (D221, K290) is feltüntettük. Hebecker and Józsi, Journal of Biological Chemistry 2012, 287:19528-19536. (XII) alapján.

37. ábra. Az FHR-4B C3b-kötőhely-mutánsainak funkcionális vizsgálata. (A) A C3b dózisfüggő kötődése az FHR-4B-hez, és annak D221G, illetve D221G és K290A mutációt hordozó változatához. (B) Az FHR-4B és a két mutáns változatának vizsgálata komplementaktivációs esszében. A rekombináns vad típusú és mutáns FHR-4B fehérjéket, a H-faktort (FH) és humán szérum albumint (HSA) ELISA lemezen immobilizáltuk, majd Mg²⁺/EGTA tartalmú pufferben hígított, 5%-os szérummal inkubáltuk. A C3-konvertáz felépülését a 34. ábrához hasonlóan detektáltuk. Az ábrák három-három kísérlet adatainak átlagát mutatják a szórásokkal. Hebecker and Józsi, Journal of Biological Chemistry 2012, 287:19528-19536. (XII) alapján.

Kimutattuk, hogy a H-faktorral ellentétben, ami a CRP módosult, monomer (vagy denaturált) formáját (mCRP) köti, az FHR-4 mindkét izoformája a natív, pentamer CRP-t (pCRP) köti (38. ábra) (XIII). A kötődést nemcsak tisztított fehérjékkel, hanem szepszises betegek emelkedett CRP mennyiséget tartalmazó szérumából is igazoltuk. Eredményeink szerint az FHR-4 képes nekrotikus sejtek felszínéhez kötődni és oda szérumból CRP-t toborozni (39. ábra) (XIII). A pCRP kötőhelye az FHR-4A és FHR-4B molekulákban közös CCP1 doménben található, amit rekombináns FHR-4 fragmentumok előállításával és CRP-kötésük vizsgálatával mutattunk ki (40. ábra) (XIV). Az ismert szekvenciák alapján tervezett, nitrocellulóz membránon immobilizált átfedő peptidsorozatok segítségével azonosítottunk a CCP1 doménben egy a CRP kötésében szerepet játszó motívumot, ami az ún. hipervariábilis hurok régióra esik (41. ábra) (XIV). A homológ szekvenciák vizsgálatával kiderült, hogy ez a rövid molekulaszakasz ilyen formában csak az FHR-4 CCP1-ben található meg, a homológ domének megfelelő szekvenciáiban található eltérések (elsősorban negatív töltésű aminosavak jelenléte) magyarázzák, hogy a többi FHR és a H-faktor homológ doménjei nem, vagy alig kötik a pCRP-t (42. ábra). A kötőhelyet egyszeres (K37A) és háromszoros (K37A, R40A, R41A) rekombináns mutáns fehérje előállításával és vizsgálatával is bizonyítottuk (43.A és 43.B ábra). Azt is kimutattuk, hogy a CRP kötődése az FHR-4-hez lehetővé teszi a klasszikus

és/vagy lektin úton elinduló komplementaktivációt, amit szérumból történő C4 depozíció mérésével igazoltunk (43.C ábra) (XIV).

38. ábra. Az FHR-4 a natív, pentamer szerkezetű CRP-t (pCRP) köti. Az 5 µg/ml koncentrációban immobilizált rekombináns FHR-4 izoformákat és tisztított H-faktort 30 µg/ml pCRP-vel, illetve a pCRP-ből urea/EDTA kezeléssel előállított mCRP-vel 140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM Tris tartalmú, pH 7.5 pufferben inkubáltuk. A CRP kötődést egy a pCRP-t és az mCRP-t is felismerő poliklonális anti-CRP ellenanyaggal detektáltuk. Az ábra négy kísérlet adatainak átlagát mutatja a szórásokkal. Mihlan et al., Molecular Immunology 2009, 46:335-344. (XIII) alapján.

39. ábra. Az FHR-4 fokozza a CRP kötődését nekrotikus sejtekhez. (A) Az FHR-4 kötődése nekrotikus sejtekhez anti-FHR-4 antiszérum segítségével, áramlási citofluoriméterrel mérve.

A nekrózist hőkezeléssel váltottuk ki. A szürke hisztogramok az antitest kontrollt mutatják, míg az üres hisztogramok a 30 µg/ml FHR-4A-val inkubált sejteket. Az élő és nekrotikus sejtek elkülönítése propídium-jodiddal való festés alapján történt. (B) CRP kötődése szérumból a nekrotikus sejtek felszínére. Az FHR-4A (CFHR4A) és FHR-4B (CFHR4B) jelenlétében megnő a sejteken kimutatható CRP-kötődés mértéke szepszises beteg szérumából. Kontrollként alacsony CRP-szintű normál humán szérumot használtunk (NHS).

Az ábra három kísérletből származó reprezentatív hisztogramokat mutat. Mihlan et al., Molecular Immunology 2009, 46:335-344. (XIII) alapján.

40. ábra. A CRP-kötő hely az FHR-4 CCP1 doménjében azonosítható. (A) Az FHR-4A-t és különböző doméneket tartalmazó fragmentumait 250 nM koncentrációban immobilizáltuk, majd pCRP-vel inkubáltuk. Az 1-3 doméneket tartalmazó fragmentum az FHR-4A-hoz hasonló mértékben kötötte a pCRP-t. (B) A CRP kötődése szérumból. Az ábrán feltüntetett fehérjéket különböző szérumokkal (2,5%) inkubáltuk, melyek közül az egészséges kontroll szérumban a CRP koncentráció <0,3 µg/ml, míg a szepszises betegek szérumában 104 µg/ml (patient 1) és 146 µg/ml (patient 2) volt. További kontrollként humán szérumból tisztított CRP-t használtunk (2,5 µg/ml). Az ábrák két kísérlet adatainak átlagát mutatják a szórásokkal. Hebecker et al., Molecular Immunology 2010, 47:1347-1355. (XIV) alapján.

41. ábra. Az FHR-4-ben a CRP-kötő peptid motívum azonosítása. (A) Az FHR-4A CCP1 doménjének és a homológ, de CRP-t nem kötő CCP5 doménjének átfedő peptidsorozatokkal való vizsgálata. A nitrocellulóz membránra nyomtatott peptideket 20 µg/ml CRP-vel inkubáltuk, és CRP-specifikus ellenanyaggal hívtuk elő (felső panel). Egy ugyanilyen membránt csak pufferrel és az antitesttel inkubáltunk (alsó panel). (B) A CCP1-ben pozitív jelet adó peptidek és a homológ CCP5-eredetű peptidek összehasonlítása; az azonosított kötőhelyben (vastag betűvel kiemelve) az eltérő aminosavakat aláhúzás jelöli. (C) A CRP-kötő motívumban egy vagy több aminosavat alaninra cseréltünk, és az (A) részben leírtak szerint vizsgáltuk a CRP-kötő képességüket. Az ábra reprezentatív eredményeket mutat be.

Hebecker et al., Molecular Immunology 2010, 47:1347-1355. (XIV) alapján.

42. ábra. A CRP-kötő motívum vizsgálata. (A) A H-faktor család tagjainak az FHR-4 CCP1 doménnel homológ doménjeinek szekvencia-illesztése. Az FHR-4-ben azonosított CRP-kötő motívum keretezéssel van jelölve. (B) A motívummal homológ szekvenciákban az aminosav-oldalláncok töltéseinek összehasonlítása. (C) A CRP-kötő és azzal homológ H-faktor/FHR peptidek CRP-kötő képességének vizsgálatát a 41. ábránál leírtak szerint végeztük el. Az FHR-4A CCP5 E284K és a H-faktor CCP6 E338K peptid-változatát is vizsgáltuk. Hebecker et al., Molecular Immunology 2010, 47:1347-1355. (XIV) alapján.

43. ábra. Az FHR-4 CRP-kötőhely mutánsainak funkcionális vizsgálata. (A) CRP kötődése a CCP1-3 fragmentum vad típusú és K37A, illetve K37A/R40A/R41A mutációkat hordozó változataihoz. (B) Az immobilizált fehérjéket CRP-vel, majd 1,5% szérummal inkubáltuk (37ºC, 30 perc). A komplementaktiváció következtében lekötődő C3-fragmentumokat anti-C3 ellenanyaggal detektáltuk. (C) Az immobilizált CCP1-3 és CCP4-9 fragmentumokat CRP-vel való inkubálás után 1,5%-os szérummal inkubáltuk. A klasszikus/lektin út aktivációjára a C4-fragmentumok lerakódása utal. Az ábrák három kísérlet adatainak átlagát mutatják a szórásokkal. Hebecker et al., Molecular Immunology 2010, 47:1347-1355. (XIV) alapján.

Eredményeink szerint tehát az FHR-4 molekula nem a komplementaktivációt gátolja, mint a H-faktor, hanem ezzel ellenkezőleg, képes a komplementaktivációt fokozni, több mechanizmus révén is. A C3b megkötése révén az alternatív, a CRP megkötése révén pedig a klasszikus/lektin út aktivációját képes elindítani, ezáltal az opszonizációt helyileg fokozni (44.

ábra).

44. ábra. A sematikus ábra az FHR-4 molekula komplementaktivációt fokozó szerepét mutatja be. Eredményeink szerint az FHR-4 az N-terminális doménjéhez (CCP1, zölddel jelölve) kötődő CRP révén a klasszikus út, a C-terminális CCP8-9 doménekhez (illetve az FHR-4B izoforma esetén a CCP4-5 doménekhez; kékkel jelölve) kötődő C3b révén az alternatív út aktivációja indulhat be.

5.3.2. Az FHR-1 jellemzése

Az FHR-1 élettani szerepéről, noha ez volt az elsőként leírt H-faktorral rokon molekula, nagyon keveset tudunk. A molekula azonosításakor már leírták, hogy nem rendelkezik a H-faktorhoz hasonló komplementgátló funkcióval, amit a H-faktor CCP1-4 doménjeivel homológ domének hiánya magyaráz (Timmann et al., 1991). Mivel az FHR-1 molekula C-terminális doménjei nagyfokú hasonlóságot mutatnak a H-faktor homológ doménjeivel, ezért vizsgáltuk, hogy ez a molekula mennyiben rendelkezik a H-faktorhoz hasonló, illetve attól eltérő biológiai funkcióval.

Megállapítottuk, hogy az FHR-1 is képes a C-terminális doménjein keresztül vörösvérsejtekhez, endotélsejtekhez (l. 25. oldal, 7.C ábra) kötődni. Az FHR-1 CCP4 doménje aminosav szinten 100%-ban megegyezik a H-faktor CCP19 doménjével, az FHR-1 CCP5 doménje pedig 97%-ban a H-faktor CCP20 doménjével. (A korábban jellemzett V1197A H-faktor mutáns (14. ábra, 4. táblázat) megfelel az FHR-1 CCP5-ben lévő egyik eltérésnek.) A két aminosavnyi különbség a C-terminális doménekben azonban ahhoz vezet, hogy az FHR-1 nem olyan erősen kötődik a sejtfelszínekhez, mint a H-faktor, és nem is tudja a H-faktort onnan hatékonyan leszorítani, ahhoz a fiziológiáshoz képest irreálisan magas FHR-1 koncentráció kellene (45. ábra) (VII).

45. ábra. A birka vörösvérsejteket (SRBC) a humán szérum komplement nem tudja lizálni, mert az emberi sejtekhez hasonlóan a H-faktor kikötődik a felszínükre és ott gátolja a komplementaktivációt. A 20% szérumban inkubált SRBC-hez 2 µM koncentrációban adtuk a feltüntetett fehérjéket. A H-faktor CCP15-20 fragmentuma (SCR15-20) a H-faktorral való kompetíció miatt az SRBC lízisét okozta. Az FHR-1 azonban nem tudta hatékonyan leszorítani a H-faktort. Strobel et al., Kidney International 2011, 80:397-404. (VII) alapján.

Kimutattuk, hogy az FHR-1 kötődik a pentraxin 3-hoz (PTX3), de gyengébben, mint a H-faktor (XV). A H-faktorral ellentétben alacsonyabb kémhatáson – ami fiziológiásan például gyulladás helyszínén fordulhat elő – az FHR-1 nem kötődik erősebben a PTX3-hoz (46.

ábra). Peptid array segítségével azonosítottuk a H-faktor és az FHR-1 C-terminális doménjeiben a PTX3-kötésben részt vevő aminosavakat (47. ábra). Megállapítottuk, hogy az FHR-1 aHUS-sal asszociált FHR-1*B izoformája gyengébben kötődik a PTX3-hoz, mint a másik izoforma. Kimutattuk, hogy az aHUS betegek autoantitestjei gátolják a PTX3 kötődését H-faktorhoz és FHR-1-hez is (48. ábra) (XV).

46. ábra. Az FHR-1 kötődik PTX3-hoz. (A) A tisztított H-faktor (CFH), FHR-1 (CFHR1), FHL-1 (CFHL1) és BSA fehérjéket 200 nM koncentrációban immobilizáltuk. A PTX3 (5 µg/ml) kötődését (37ºC-on, 1 óráig történő inkubálás után) ELISA-val, specifikus antitest segítségével detektáltuk. A H-faktor kötődésére normalizált adatok három kísérlet átlagát mutatják a szórásokkal. (B) A PTX3-kötődés mérését eltérő pH-jú pufferekben is elvégeztük, a kötődés pH-függésének vizsgálata céljából. A pH 7,4-en mért kötődésre normalizált adatok öt kísérlet átlagát mutatják a szórásokkal. C4BP: C4b-kötő fehérje. * p < 0,05 és ** p < 0,01, Student t-teszt. Kopp et al., The Journal of Immunology 2012, 189:1858-1867. (XV) alapján.

47. ábra. Az FHR-1 és a H-faktor C-terminális doménjében lévő PTX3-kötő hely azonosítása. (A) A H-faktor CCP19 és CCP20 doménjének szekvenciáit átfedő peptid-sorozatokra bontottuk. A nitrocellulóz membránra nyomtatott peptideket 5 µg/ml PTX3-mal és anélkül inkubáltuk, majd PTX3-specifikus ellenanyaggal előhívtuk. A CCP20-ban (amely 2 aminosavban tér csak el az FHR-1 homológ doménjétől) két peptid motívumot azonosítottunk (1180-1186 és 1198-1204), melyek a domén felszínén egymás mellett helyezkednek el (B). Két kísérletből egy reprezentatív eredményt mutat az ábra. A CCP19 doménben ezzel a megközelítéssel nem tudtunk a PTX3-kötésben részt vevő aminosavakat kimutatni. A (B) ábra a H-faktor CCP19-20 ismert szerkezetének alapján készült (Jokiranta et al., 2006; PDB: 2G7I). Kopp et al., The Journal of Immunology 2012, 189:1858-1867. (XV) alapján.

48. ábra. (előző oldal) Az FHR-1 PTX3-mal való kölcsönhatásának vizsgálata. (A) A C18 jelű monoklonális antitest, amely az FHR-1 CCP5 (a H-faktor CCP20-szal homológ) doménjében kötődik, gátolja a PTX3 kötődését FHR-1-hez. (B) A H-faktor és az FHR-1 két izoformájának C-terminális doménjei csak 5 (CFHR1*A), illetve 2 (CFHR1*B) aminosavban különböznek. (C) A CFHR1*B izoformához kevésbé kötődik a PTX3. Az adatok három kísérlet átlagát mutatják a szórásokkal. (D) Egészséges egyénekből (C1-C5) és H-faktor autoantitestre pozitív aHUS betegekből (P1-P9) izolált IgG (100 µg/ml) kötődése immobilizált H-faktorhoz, illetve FHR-1-hez. Az adatok három kísérlet átlagát mutatják a szórásokkal. (E) PTX3 kötődése az IgG frakciókkal előinkubált immobilizált FHR-1-hez. Az ábra az IgG-t nem tartalmazó kontrollra normalizált adatok átlagát mutatja a szórásokkal, három kísérletből. * p < 0,05 és ** p < 0,01, Student t-teszt. Kopp et al., The Journal of Immunology 2012, 189:1858-1867. (XV) alapján.

Mivel az FHR-1-ről leírták, hogy a C5-höz kötődve a terminális út aktivációját gátolja (Heinen et al., 2009), ebben az irányban is végeztünk vizsgálatokat. Ismert, hogy egyes gyógyszerek vagy azok hordozói (pl. liposzómák) képesek a komplementrendszer aktiválására, és részben ennek a mechanizmusnak köszönhetően ún. infúziós reakció (egyfajta túlérzékenységi reakció) kiváltására. Ezt a jelenséget komplementaktivációval kapcsolatos pszeudoallergiás reakciónak (complement activation-related pseudoallergy, CARPA) nevezték el (Szebeni, 2005). Amennyiben például liposzomális amphotericin B-t, egy gombaellenes szert, inkubálunk szérumban, a kontrollhoz képest megnő a szérumban mérhető szolubilis C5b-9 terminális komplement komplex mennyisége. Ezt a növekedést a komplementaktiváció gátlása révén a H-faktor szignifikánsan csökkenteni képes, ugyanakkor az FHR-1-nek semmiféle hatását nem tapasztaltuk (XVI). Eredményeink tehát cáfolják az FHR-1 korábban leírt, komplementgátló hatását. Más kutatócsoportok ugyancsak megkérdőjelezték a Heinen és munkatársai által közölt hatást, ellenben azt találták, hogy az FHR-1 a C3b-hez kötődve gátolni tudja a H-faktor hatását, ezzel a komplementaktivációt inkább fokozza (Goicoechea de Jorge et al., 2013; Tortajada et al., 2013).

5.3.3 Az FHR-5 molekula funkciójának vizsgálata

Mivel az utóbbi években genetikai vizsgálatok alapján a CFHR5 gént egyértelműen összefüggésbe hozták egyes vesebetegségekkel, de a molekula funkciója ismeretlen volt, célul tűztük ki az FHR-5 funkcionális jellemzését. Ehhez rekombináns FHR-5 molekulát használtunk. Miután az FHR-4 és az FHR-1 vizsgálata során a CRP-t, illetve a PTX3-at mint ligandumokat azonosítottuk, elsőként az FHR-5 pentraxinokkal való kölcsönhatását

tanulmányoztuk. Mind emberi szérumot, mind a rekombináns FHR-5-öt használva kimutattuk, hogy az FHR-5 köti a PTX3-at, ráadásul a H-faktornál nagyobb aviditással (49.

ábra). A vizsgált fehérjék közül az FHR-4A minimális PTX3-kötést mutatott, ami mások adataival is egybevág (Deban et al., 2008). Az FHR-1 a H-faktorhoz képest gyengébb, míg az FHR-5 erősebb PTX3-kötést mutatott. A PTX3 – FHR-5 kölcsönhatásra meghatározott Kd

értéke 6,07 ± 1,42 × 10^-9 M, ami a H-faktorra mások által leírt értékhez képest jóval nagyobb kötés-erősséget jelez (Kd = 1,1 ± 0,13 × 10^-7 M; Deban et al., 2008). Ennek megfelelően az FHR-5 dózisfüggően gátolta a H-faktor kötődését hoz, aminek következtében a PTX3-hoz kötött H-faktor kofaktor aktivitása jelentősen csökkent (50. ábra) (XVII).

49. ábra. Az FHR-5 kölcsönhatása PTX3-mal. (A) Zselatinnal és PTX3-mal fedett ELISA lemezeket blokkolás után 25% normál humán plazmával (NHP) inkubáltunk, majd mosás után az SDS-mintapufferrel való eluálás után a fehérjéket 10%-os SDS-PAGE-n futtattuk, majd blottoltuk. A membránt anti-FHR-5 ellenanyaggal hívtuk elő. (B) Zselatinnal és PTX3-mal fedett ELISA lemezeken hígítási sorban adott H-faktor (FH) és FHR-5 kötődését poliklonális anti-humán H-faktor ellenanyaggal detektáltuk. Négy kísérlet adatainak átlaga ±

In document A H-faktor molekulacsalád tagjainak élettani funkciója és szerepük komplement-közvetítette betegségekben (Pldal 55-76)