Rekombináns mini H-faktor előállítása, jellemzése

Amint az az előzőekből is kiderült, a H-faktor két fő funkcionális egysége a molekula két végén elhelyezkedő, a komplementgátlásért (CCP 1-4) és a sejtekhez kötődésért (CCP 19-20) felelős rész. Felmerült ezért, hogy elegendőek-e ezek a domének a teljes molekula funkciójának az ellátásáért. Előállítottuk tehát azt a mini H-faktornak elnevezett molekulát, amelyben ezt a két funkcionális egységet közvetlenül összekapcsoltuk (58. ábra).

58. ábra. A mini H-faktor sematikus szerkezete. A mesterséges molekula a H-faktor N-terminális, komplementgátló CCP1-4 (sárga) és a C-N-terminális, sejtekhez/ligandumokhoz való kötődését biztosító CCP19-20 (kék) doménjeit egyesíti. Hebecker et al., The Journal of Immunology 2013, 191:912-921. (XIX) alapján.

59. ábra. A mini H-faktor feltételezett kölcsönhatása a saját sejtek felszínére lekötődött C3b-vel. A komplementszabályozó CCP1-4 doméneket sárga, míg a sejtfelszínre kovalensen lekötődött C3b-hez és sziálsavhoz/gükózaminoglikánokhoz kötődni képes CCP19-20 doméneket kék szín jelzi. A sematikus ábra a H-faktor irodalmi adatok (különösen a C3b és CCP1-4, illetve C3b és CCP19-20 komplexek kristályszerkezetének ismerete) alapján készült.

Hebecker et al., The Journal of Immunology 2013, 191:912-921. (XIX) alapján.

Feltételeztük, hogy a mini H-faktor az eredeti molekulához hasonlóan képes lehet a sejtfelszínre kötődött C3b inaktiválásában közreműködni, a komplementaktivációt gátolni (59. ábra). Egy ilyen kisebb méretű fehérjemolekulának előnye lehetne, hogy könnyebb lenne előállítani, mint a H-faktort; a mini H-faktort alkotó doménekben nincs glikozilációs hely, így többféle expressziós rendszerben is termelhető volna például terápiás célra.

Az előállított rekombináns fehérjét részletesen jellemeztük egyes ligandumokhoz való kötődését és komplementgátló aktivitását illetően. Megállapítottuk, hogy ez a mesterséges molekula hasonlóképpen kötődik C3b-hez, mint a faktor, amit az magyarázhat, hogy a faktor két fő C3b-kötő helye a mini faktorban is megtalálható. A C3d-kötése a mini H-faktornak ugyanakkor erősebbnek bizonyult (60. ábra).

60. ábra. A mini H-faktor kölcsönhatása C3 fragmentumokkal. ELISA segítségével vizsgáltuk 100 nM koncentrációban immobilizált mini H-faktor és a H-faktor esetében a C3b (A) és a C3d (B) megkötését a folyadék fázisból. A C3b kötődését anti-C3, a C3d kötődését anti-C3d ellenanyag segítségével mértük. Az ábrákon bemutatott adatok 3-3 kísérlet átlagai a szórásokkal. A C3d kötődése a mini H-faktorhoz szignifikánsan nagyobb mértékű volt, mint a H-faktorhoz való kötődése (p < 0,001, kéttényezős varianciaanalízis). Hebecker et al., The Journal of Immunology 2013, 191:912-921. (XIX) alapján.

A mini H-faktor – a natív H-faktorhoz hasonlóan – rendelkezik kofaktor- és C3-konvertáz lebomlást gyorsító aktivitással (61. ábra). Ugyancsak a H-faktorhoz hasonló kötődést tapasztaltunk a PTX3 és MaxGel esetében is. A CRP esetében azonban a H-faktor erősebben kötődött, mint a mini H-faktor, amit az magyaráz, hogy a H-faktor CCP7 doménjében is van egy CRP-kötő hely, ami viszont a mesterséges molekulából hiányzik. A mini H-faktor a pentraxinokhoz kötődve is képes volt kofaktor aktivitást kifejteni (62. ábra).

A mini H-faktor esetében a természetes molekulához képest hatékonyabb komplementgátló hatást tapasztaltunk funkcionális esszékben, amikor endotélsejteken zajló komplementaktiváció gátlását (63. ábra) és humán szérum birkavörösvérsejteket lizáló hatását vizsgáltuk (64. ábra). Mind mutáns H-faktort, mind autoantitesteket tartalmazó, aHUS betegekből származó szérum kezelés esetén a mini H-faktor kb. négyszer kisebb moláris koncentrációban érte el ugyanazt a mértékű gátló hatást, mint a tisztított H-faktor. Ez feltehetőleg annak köszönhető, hogy a kompakt molekula térszerkezete eltérő, és a C-terminális C3b-kötő hely jobban hozzáférhető, mint a természetes, 20 doménből álló molekulában (XIX).

61. ábra. A mini H-faktor komplementszabályozó funkciójának vizsgálata. (A) Az alternatív út C3-konvertázának lebomlását segítő aktivitást ELISA lemezeken, a komponensekből felépített C3bBb konvertáz segítségével vizsgáltuk. A felépített konvertázhoz mini H-faktort, H-faktort vagy humán szérum albumint (HSA) adtunk, majd 30 percig 37ºC-on történő inkubálás után a maradék konvertázt anti-B-faktor antitesttel detektáltuk. Az ábra három kísérlet átlagát mutatja a szórásokkal. (B) A mini H-faktor kofaktor aktivitását folyadék fázisban vizsgáltuk. C3b-t inkubáltunk I-faktorral és 10 nM koncentrációjú H-faktorral vagy mini H-faktorral (37°C, 1 óra). A C3b hasítását 11%-os redukáló SDS-PAGE-n történő futtatást és a szeparált fehérjék nitrocellulóz membránra történt blottolását követően poliklonális anti-C3 ellenanyaggal detektáltuk. A molekulasúly marker az ábra bal oldalán, a C3b láncok és hasítási termékek a jobb oldalán vannak jelezve. A blot három kísérlet eredményét reprezentálja. Hebecker et al., The Journal of Immunology 2013, 191:912-921.

(XIX) alapján.

62. ábra. A mini H-faktor pentraxinokhoz kötődve is funkcionálisan aktív. (A) ELISA lemezeket PTX3-mal, illetve CRP-vel fedtünk. A mini H-faktor és a H-faktor kötődését az ábrán feltüntetett koncentrációkban H-faktor antiszérum segítségével mértük. Az ábra három kísérlet átlagát mutatja a szórásokkal. A H-faktor szignifikánsan erősebben kötődött a CRP-hez, mint a mini H-faktor (p < 0,001, kéttényezős varianciaanalízis), míg a PTX3-hoz való kötődésükben nem volt különbség. (B) ELISA lemezen immobilizált PTX3-hoz, illetve CRP-hez 1 µM koncentrációban adtunk H-faktort vagy mini H-faktort. A nem kötődött fehérjék kimosása után C3b-vel és I-faktorral inkubáltuk a lemezeket (37°C, 1 óra). A felülúszókban a C3b hasítását 11%-os redukáló SDS-PAGE-n történő futtatást és a szeparált fehérjék nitrocellulóz membránra történt blottolását követően C3-specifikus poliklonális ellenanyaggal detektáltuk. A molekulasúly marker az ábra baloldalán (kDa-ban), a C3b α’- és β-lánca, valamint az α’-lánc hasítási termékei pedig a jobb oldalán vannak feltüntetve. Az ábra két kísérletből származó reprezentatív eredményt mutat. Hebecker et al., The Journal of Immunology 2013, 191:912-921. (XIX) alapján.

Az FHR-1-gyel kapcsolatos kísérletek leírása során már ismertetett CARPA reakcióban is vizsgáltuk, hogy a mini H-faktor mutat-e, és ha igen, mekkora komplementaktivációt gátló hatást. Azt találtuk, hogy liposzomális amphotericin B, a cremophor EL micellák és a rituximab terápiás monoklonális antitest által szérumban kiváltott komplementaktiváció esetében is in vitro a mini H-faktor a H-faktorénál mintegy kétszer hatékonyabban gátolta a szolubilis terminális C5b-9 komplex képződését (65. ábra) (XVI).

63. ábra. A mini H-faktor endotélsejtekhez kötődve is funkcionálisan aktív. (A) A H-faktor (FH) és a mini H-faktor (Mini-FH) kötődése 2 µM koncentrációban HUVEC sejtekhez, áramlási citometriás módszerrel mérve. Reprezentatív hisztogramok három kísérletből. (B) A H-faktor és mini H-faktor kötődése Western blottal kimutatva, az előzőek szerint inkubált HUVEC sejtek lizátumából. A sejtlizátumokat 11% SDS-PAGE gélen futtattuk, nitrocellulóz membránra blottoltuk, és H-faktor specifikus antitesttel hívtuk elő. Az ábra két kísérletből származó reprezentatív eredményt mutat. (C) Sejtes kofaktor esszé. A HUVEC sejteket 2 µM mini H-faktorral, illetve H-faktorral inkubáltuk. A nem kötődött molekulák kimosása után a sejteket PBS-ben szuszpendáltuk fel, majd C3b-t és I-faktort adtunk ehhez a sejtszuszpenzióhoz. 30 percig 37ºC-on inkubáltuk, majd a felülúszót 11%-os redukáló SDS-poliakrilamid gélen futtattuk, nitrocellulóz membránra blottoltuk, és a blottot C3-specifikus antiszérummal hívtuk elő. A molekulasúly marker az ábra baloldalán (kDa-ban), a C3b α’- és β-lánca, valamint az α’-lánc hasítási termékei pedig a jobb oldalon vannak feltüntetve. Az ábra két kísérletből származó reprezentatív eredményt mutat. (D) Aktivált HUVEC sejteket 30 percig 30% H-faktor-depletált szérumban inkubáltunk 5 mM Ca²⁺ és Mg²⁺ jelenlétében, a H-faktort és a mini H-faktort az ábrán feltüntetett koncentrációkban adva. A sejtek felszínén a C3-fragmentumok lerakódását áramlási citometriával mértük, anti-C3c ellenanyaggal. Az ábra három kísérlet átlagát mutatja a szórásokkal. A H-faktor és a mini H-faktor gátló hatása között szignifikáns különbség volt (p = 0,0009, kéttényezős varianciaanalízis). Hebecker et al., The Journal of Immunology 2013, 191:912-921. (XIX) alapján.

64. ábra. A mini H-faktor gátolja az aHUS-asszociált H-faktor mutáció és H-faktor autoantitestek által okozott birka vörösvérsejt (BVVS)-lízist. (A) A W1183L mutációt a CCP20 doménben heterozigóta formában hordozó beteg széruma a BVVS lízisét okozza. A 10%-os szérum koncentráció esetében a BVVS kb. 70%-ának lízisét tapasztaltuk. (B) Egy aHUS beteg anti-H-faktor autoantitesteket tartalmazó plazmája 6%-os koncentrációban a BVVS kb. 80%-ának lízisét okozta. A H-faktor és a mini H-faktor dózisfüggően gátolta a BVVS lízist. Az ábrák két-két kísérletből származó reprezentatív eredményeket mutatnak.

Hebecker et al., The Journal of Immunology 2013, 191:912-921. (XIX) alapján.

C

65. ábra. (C) A rituximab SC5b-9 emelkedést okoz lepirudin véralvadásgátlót tartalmazó plazmában, melyet az előzőekhez hasonlóan az 1,3 µM végkoncentrációban adott H-faktor és mini H-faktor gátolnak. Három plazma donorral végzett kísérlet átlaga + SEM. * p < 0,05 és ns: nem szignifikáns. Mészáros et al., Nanomedicine 2016, 12:1023-1031. (XVI) alapján.

65. ábra. A liposzomális amphotericin B (AmBi) és cremophor EL micellák (CrEL) által szérumban kiváltott komplementaktiváció gátlása. Mind az AmBi (A), mind a CrEL (B) humán szérumhoz adva jelentős SC5b-9-szint emelkedést okoz. A H-faktort (FH) és a mini H-faktort (Mini-FH) 1,3 µM-os végkoncentrációban adtuk. Az ábra 5 (A) és 6 (B) szérummal végzett kísérlet adatainak átlagát + SEM mutatja. * p <

0,05 és *** p < 0,001.

A mi munkacsoportunkkal párhuzamosan két másik kutatócsoport is előállított hasonló mini H-faktor molekulákat. Az egyik a két funkcionális egység közötti összekötő szekvenciában különbözik, miáltal nagyobb az egységek közötti flexibilitás, és ez a molekula az általunk előállítottnál még hatékonyabban gátolja a komplementaktivációt (Schmidt et al., 2013). A másik a H-faktor CCP 1-5 és CCP 18-20 doménjeiből áll, egerekben in vivo is képes a komplementaktiváció gátlására, és arra fogékony egerekben a vesében történő C3 fragmentum lerakódás csökkentésére (Nichols et al., 2015).

Közös kutatás keretében összehasonlítottuk a háromféle mini H-faktor molekulát, valamint egy másik rekombináns fehérjét, ami a H-faktor CCP 1-5 doménjeit és a CR2 komplement receptor iC3b/C3d-kötő doménjeit tartalmazza (66. ábra). Az eredmények szerint a flexibilis kapocs régióval rendelkező mini H-faktor molekula a leghatékonyabb komplement inhibitor a vizsgáltak közül a paroxizmális nokturnális hemoglobinuriában (PNH) szenvedő betegek vörösvérsejtjein zajló komplementaktiváció megakadályozásában (67. ábra) (XX).

Ezeken a vörösvérsejteken egy szerzett génhiba miatt különböző mértékben csökkent két komplementszabályozó membránfehérje (a DAF és a CD59) expressziója, ezáltal folyamatos komplementaktiváció zajlik a felszínükön, ami a vörösvérsejtek pusztulásához vezet. Az anti-C5 terápiás ellenanyag, az eculizumab megakadályozza a vörösvérsejtek C5b-9 komplex általi lízisét, de a folyamatos komplementaktivációt és C3 fragmentum lerakódást nem, ami a vörösvérsejtek komplement receptorokon keresztüli opszonofagocitózisához és így extravaszkuláris pusztulásukhoz vezet (Lin et al., 2015). Megemlítendő még az is, hogy a terminális út teljes gátlása miatt jelentősen nő a meningococcus fertőzés okozta agyhártyagyulladás kockázata is, amit a profilaktikusan alkalmazott védőoltás vagy antibiotikumos kezelés nem minden esetben tud megakadályozni. Ezért tehát mindenképpen indokolt más hatásmechanizmusú komplement inhibitorok fejlesztése, amelyek a mikrobák opszonizációját lehetővé teszik, de a saját sejteken lezajló komplementaktivációt gátolják (Ricklin and Lambris, 2016). A mini H-faktorok optimalizálása és alkalmazása egy ilyen terápiás beavatkozást jelenthet.

66. ábra. A vizsgált C3 opszonin-célzott mesterséges komplement inhibitorok vázlatos szerkezete. A számok az egyes fehérjék aminosavsorrendjén alapulnak (a szignálpeptiddel együtt számolva). Az oválisok a CCP doméneket szimbolizálják, és az egyes domén-számokkal vannak jelölve. A kapocs régiókat és a rekombináns fehérjék tisztításához használt címkéket keretezés jelzi. A CCP domének fő funkciói alul vannak feltüntetve. Schmidt et al., Immunobiology 2016, 221:503-511. (XX) alapján.

67. ábra. vörösvérsejtek védelme az alternatív út okozta lízistől. A vörösvérsejteket savanyított szérumban inkubálva az alternatív út aktivációja miatt a PNH-vörösvérsejtek lizálódnak. A kísérletben a PNH PNH-vörösvérsejteket 24 órán át, savanyított szérumban (75%), a vizsgált mesterséges komplementgátló molekulákkal inkubáltuk. A PNH-vörösvérsejtek lízisét áramlási citofluoriméterrel mértük. Az adatokat a komplement-inhibitorok nélküli mintákban mért lízisre normalizáltuk. Négy kísérlet átlaga a szórásokkal.

Schmidt et al., Immunobiology 2016, 221:503-511. (XX) alapján.

6. Összefoglalás és kitekintés