Termikus előélet, memória effektus

Az előátmenet, a gél és a hullámos gél állapotok közötti átmenet a DPPC molekula relatíve nagyméretű (~0,60 nm²), poláris, kolincsoportot tartalmazó fejcsoportjának jelenlétére vezethető vissza (22. ábra). A hőmérséklet növekedésével a fejcsoportok közötti nagyobb egyensúlyi távolság a szomszédos lipid molekulákat arra kényszeríti, hogy a kettősréteg által alkotott sima gömbhéjból kimozduljanak és így a gömbhéj egészének periodikus gyűrődését okozzák. A fázisátmenet átalakulási hője (a mért entalpiaváltozás 4,2 kJ/mol lipid) lényegesen alacsonyabb, mint a főátmeneté (38 kJ/mol·lipid) [203].

A lassú (kis fűtési vagy hűtési sebességű hőkezeléseket „kvázi egyensúlyi”

körülményeknek nevezik. Méréseim során a gyakorlatilag kivitelezhető legkisebb fűtési sebességnél is tapasztaltam a termikus előélet jelenségét (a vizsgált állapotot megelőző állapot hőmérsékletének hatása). A vizsgálat tárgyát képező előátmenet hőmérséklettartománya a DPPC–víz rendszer esetében 30 – 36°C közötti intervallumban van. Az előátmenet diszkrét pontjainál néhány nap – hét nagyságrendű termosztálások után alakult ki az egyensúlyi állapot, pontosabban az ahhoz tartozó szerkezet. (Egyensúlyi állapot alatt azt az állapotot értem, ami az időben állandósul, nem mutat változást.) A 3 napig termosztált gél (Lß', 28 °C) és hullámos gél (Pß', 38 °C) mintákat az előátmenet tartományában, 30,0; 31,1; 32,2; 33,5;

34,7; 35,9; 37,1°C hőfok értékeken termosztáltam. 1 nap termosztálási idő után, a rétegszerkezet Bragg csúcsainak változása alapján az átmenet hőmérsékletére (az a hőmérsékleti érték, ahol a csúcs alakja átmeneti formát mutat) becsülhető érték függ a hőkezelés módjától, a melegített (fűtött) minta esetében ~ 33,5 °C, a hűtött minta esetében ~ 31 °C. A mintákat hosszú időn át termosztálva a termikus előélet megszűnt. A Bragg profilok alapján a minták szerkezete 8 nap után állandósult. A szórásgörbék diffrakciós Bragg csúcsait a 72. ábra mutatja be, az első nap és a nyolcadik napon kialakult állapotokra vonatkozóan. Az átmenet hőmérséklettartománya széles, kb. 4 – 4,5°C.

72. ábra Az előátmenethez tartozó hőmérséklettartományában kialakult átmeneti szerkezetek szórásgörbéi (A: 1 nap termosztálás után, B: 8 nap termosztálás után, fűtés=vastag, hűtés=vékony vonal)

A 72. ábrán bemutatott 1. rendű Bragg profilokat a két egymásba alakuló szerkezet (az Lß', és a Pß') Bragg profiljainak összegeként írtam le. A Bragg csúcsokat Lorentz típusú függvénnyel illesztettem:

C fwhm q

q A

q

I( )= [1+4⋅(( − _csúcshely)/ )²]+ (36)

ahol fwhm a csúcs teljes szélessége a csúcsmaximum felénél (röviden: félértékszélesség), A és C konstansok. A fázisok állapotának jellemzésére az első Bragg csúcs fwhm-jének reciprokát választottam. A félértékszélesség a 5.2.2. pontban ismertetett módon a konstruktívan interferáló rétegek átlagos számával arányos. A vizsgált két alapfázis közül az L_ß' a rendezettebb, ezért ennek 28 °C-on (mint referencia állapothoz viszonyított) meghatározott értéket, 1/fwhm-et, 1-re normáltam, és ehhez az n=1 kontroll-paramétert rendeltem. A teljesen rendezetlen állapot félértékszélessége végtelen lenne, amelyhez az n=0 kontroll-paraméter tartozik. A P_ß' fázis (38 °C-on mért) kontroll-paramétere n=0,75 (±0, 01). Az 73. ábra a termikus előélet hatását mutatja be a kontroll-paraméter segítségével [202].

0.01 0.02 0.01 0.02

s [1/Å]

Relatív intenzitás [tetszőleges tengelyegység]

A B

37.1 °C 35.9 °C 34.7 °C 33.5 °C 32.2 °C 31.1 °C 30 °C

73. ábra A termikus előélet hatása az előátmenet tartományában rövid (1 nap) és hosszabb ideig (8 nap) termosztált DPPC – víz rendszer rétegszerkezetére, a kontroll-paraméterrel (n(T)) jellemezve

Praktikus okok miatt áttértem rövidebb ideig tartó (10-14 nap helyett 5 napig tartó) hőkezelési folyamatok hatásának tanulmányozására [153,201]. A további rétegszerkezet változása mellett a 73. ábrán bemutatott állapotokban a minták teljes kis- és nagyszögű szórásának diffrakciós reflexióit vizsgáltam. A Bragg reflexiók profilanalízisével, a 39 –es összefüggés felhasználásával meghatároztam az átmeneti állapotok fázisösszetételét, amelyet az 74. ábra segítségével mutatok be.

74. ábra Az Lß' és a Pß' fázisok réteg- és alrács arányainak változása az előátmenet hőmérsék-lettartományában (új minták preparálásával, 3 független mérési sorozat eredményei). A kerek szimbólum a P_ß', a háromszög az L_ß' fázisokra, az üres szimbólum a rétegrácsra, a teli szimbólum az alrácsra vonatkozik.

Az Lß' fázis esetében a rétegszerkezet és a rétegen belüli szerkezet (alcella) szimultán változik a fázisátmenet során (az 50 %-os arány kb. 31,3 ±0,2 °C-nál van). A Pß' fázisnál a rétegszerkezet és az alrács nem azonos arányban változik, a rétegszerkezet 50 %-os aránya 33

30 32 34 36 38

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

8 nap

Kontroll-paraméter

T, °C

30 32 34 36 38

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8

1.0 1 nap

38 °C 28 °C

30 31 32 33 3 4 35 3 6

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Fázisarány, %

T, °C

°C-ra tolódik. Tehát az előátmenet során az alrács átrendeződésével járó rövidtávú rend alacsonyabb hőmérsékleten (~31°C) alakul ki, mint a rétegszerkezet átformálódásával járó hosszútávú rend (~33°) [201].

A termikus előéletnek egy összetettebb (további hőkezelések során is megjelenő) formáját figyeltem meg, amit memória effektusnak neveztem el. Az effektust háromlépéses hőkezelési folyamat váltotta ki. Először egy átmeneti szerkezeti forma alakult ki a fázisátmeneti hőmérséklettartományban, ami hűtés után (28°C-on) Lß' fázisállapotnak megfelelő formába jutott (második lépés). Harmadik lépésben, 38°C-on, a várakozással ellentétben, nem a Pß' állapotra jellemző rétegszerkezet, hanem az első állapotra jellemző, rosszul korrelált struktúra tért vissza. A vizsgálatot az előátmenet teljes hőmérséklettartományában (30 – 35 °C) elvégeztem. Hosszú ideig (legalább 3 napig) termosztált mintákat készítettem elő (1. lépés), majd minden mintát 28 °C-ra hűtöttem, és legalább 1 napig termosztáltam az Lß' fázisnak megfelelő szerkezet kialakításához (2. lépés).

Végül a 3. lépésben minden mintát 38 °C-ra melegítettem és legalább 1 napig termosztáltam P_ß' fázis szerkezetének kialakításához. A sorozatos hőkezelés után az öt darab minta (ami az első lépésben 5 különböző hőmérsékleten került termosztálásra) lényegesen eltérő rétegszerkezetet mutatott. A 2. és a 3. lépéshez tartozó rétegszerkezet-változást a kontroll-paraméter hőmérsékletfüggése alapján az 75. ábrán mutatom be.

75. ábra A rétegszerkezet formálódásának memóriája (az első és a harmadik lépésben formálódott szerkezetek hasonlatossága = a minta 38°C-on „emlékezik” két hőkezelést megelőző állapotára). A memória „nagyságát” a második (n(T=28°C)) és a harmadik (n(T=38°C)) kezelés kontroll-paraméter görbéinek különbsége illusztrálja (n(T=38°C) (az első hőkezelés az 73. ábra által bemutatott kontrollparaméter görbéjéhez (n(T)-hez) hasonló)

A 75. ábra „x” tengelyén a hőmérséklet van, az első lépés értékeinek (mint vizsgált paraméter) bemutatására. A piros vonalnak 100%-os reverzibilitás esetén az n=1 kontroll paraméternél, mint vízszintes kellene futnia (az L_ß' referencia állapotnak megfelelően). Ezzel

29 30 31 32 33 34 35 36

0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

38 °C 28 °C

Kontroll-paraméter

T, °C

szemben n(T)=0.95±0.02 egyenes figyelhető meg, ami a mérési hibahatárt tekintve, az elvárt szerkezeti változást tükrözi. Egyedül a T=31°C környezetének minimuma mutat az első hőkezelésre, azaz „termikus előéletre” utaló jelet. A harmadik lépés (38°C-os termosztálás) eredményét a fekete színű vonal mutatja. Az összehasonlíthatóság és egyben az effektus bemutatásának érdekében mindkét alapfázis (Lß',) kontroll-paraméterét 1-re normáltam (

75 . 0 / ) ( )

( '

' T n T

n_{Pβ normált} = _Pβ ). 100%-os reverzibilitás esetén ennek a vonalnak is konstansnak,

n(T)=1-nek kellene lennie, ezzel szemben egy kifejezett minimumot mutató görbe adódik. A két (a piros és fekete) görbe különbsége mutatja a perturbált rétegszerkezet visszatérését mutató „memória”, effektust. Az effektus az átmeneti tartományban keletkezett és a szomszédos fázisokban eltérő mértékben alakuló szerkezeti hibák képződésével magyarázható. A 75. ábra alapján bemutatott jelenség a rétegszerkezet kisszögű diffrakcióval megfigyelt hőmérséketfüggő változásaira vonatkozik. A kisszögű vizsgálatokkal egyidőben elvégzett nagyszögű mérésekkel az alrácsban semmiféle termikus előéletre utaló effektust nem tapasztaltam [201].

A Pß' fázis rétegszerkezete széles hőmérsékleti intervallumban változik. A 74. ábrán bemutatott szerkezeti jellemzők alapján e fázis aránya a 30,5 és 36°C közötti tartományban, 0-ról, a 38°C-os állapothoz viszonyított, hozzávetőlegesen a 70%-os értékig növekszik.

Formálódása döntően az alcellája kialakulásához szükséges hőmérséklet (~31.3°C) feletti tartományban zajlik. A megfelelően kivitelezett DSC mérések alapján ebben a tartományban az entalpiaváltozás csekély, tehát a rétegváltozást nem kíséri jelentős hőváltozás.

Mindemellett a megnövekedett termikus fluktuációk, hibahelyek (réteghibák) kialakulásának kedveznek. A hibahelyes rétegszerkezet képződéséhez szükséges energiatöbbletet a konfigurációs entrópia növekedéséből származó energiatag fedezi. A hibahelyek kialakulása a rétegek korrelációvesztésével és a rétegkötegek alakjának deformációjával, görbülésével jár együtt. A P_ß' fázisban a hibahelyek kialakulása nagyobb szabadentalpia csökkenéssel jár, mint az Lß' fázisban, ezért a hibahelyek képződése a hullámos gél (Pß') fázisban kedvezményezett, a gél (L_ß') fázisban pedig kevésbé kedvezményezett [204]. A különbség vezet a hibahelyek kialakulásának és azok „tárolódásának” (=”befagyásának”) egyfajta aszimmetriájához a két fázisban, ami termodinamikai magyarázatot szolgáltat a réteghibák memória effektusára. A termikus fluktuációk mellett a mindig jelenlévő szennyezők hatása sem hanyagolható el. A szennyezők a határrétegben koncentrálódnak és lokális jelenlétükkel a hibahelyek kialakítását és formálását jelentős mértékben befolyásolják [205,206].

76. ábra A gél és a hullámos gél fázisok felületi morfológiája, nagyméretű liposzómák felületének részletei