5.2 R ÉTEGES LIOTRÓP RENDSZEREK
5.2.3 A DPPC/víz alapú vezikulák előátmenetének sajátságai és következményei
5.2.3.2 A 2,4-diklórfenol hatása a DPPC-víz rendszer előátmenetére
A DPPC-víz rendszerhez adott harmadik komponens a fejcsoport közelében elhelyezkedve az előátmenet kialakulásához vezető alapvető kölcsönhatási formákat megváltoztatja, vagy azt lényegesen befolyásolva az elsőrendű fázisátmenetet teljesen meg is szüntetheti. A kifejtett hatás mértéke a hozzáadott „vendégmolekula” kémiai karakterétől és koncentrációjától függ. A poláris vagy amfoter kémiai karakterű molekulák várhatóan a kettősréteg fejcsoportjaihoz közeli, vagy kifejezetten a fejcsoportok közötti térrészekben lokalizálódnak. Az előátmenetet a szakirodalom szerint számos molekula befolyásolja. Az előátmenet karakterének változása, a változás mértéke és a „vendégmolekula” koncentrációja közötti összefüggések a biológiai membránok működése szempontjából lényegesek. A harmadik komponens koncentrációjának növekedésével az előátmenet entalpiaváltozása végletesen csökken (a fázisátmenet karaktere az elsőrendű helyett gyengén elsőrendű lesz) és elérheti a nullát is (a fázisátmenet karaktere régebbi szóhasználattal „másodrendű”, újabb szóhasználattal, folytonos lesz). A fázisátmenet hőmérsékleti tartománya kiszélesedik. Az átmeneti állapotok szerkezete nagymértékben eltér az alap lipid-víz rendszer fázisátmenete során kialakuló formákétól. A folytonos fázisátmenetre jellemzően a fluktuációk megnőnek, a rendszer „frusztrált” állapotba kerül. A hibahelyek száma drasztikusan megnő, a nyomnyi szennyezők koncentrálódnak és lokálisan olyan szerkezetek alakulhatnak ki, amelyek tipikusan csak a szennyező lényegesen nagyobb arányánál fordulnak elő.
A 2,4-diklórfenol „vendégmolekula” (továbbiakban DCP-vel jelölve) hatását a DCP/DPPC mólaránnyal kifejezett széles koncentrációtartományban (~10-5 – 100 DPC/DPPC között változtatva) tanulmányoztam 20 tömegszázalékos lipid rendszerben. A 2,4-diklórfenol kis koncentrációnál is megfigyelhető változást okozott a DPPC-víz rendszer termotróp sajátságaiban, amelyet a 77. ábra mutat. A változás mind az előátmenetben, mind a fő átmenetben jelentős volt [207]. A 77. ábra alapján megfigyelhetjük, hogy a főátmenet az
0 .2 5µµµµm 0.3 µm0.15µµµµm
0.5 µm
14 nm
egész vizsgált tartományban megjelenik, az előátmenet DCP/DPPC=0,02 mol/mol arány felett nem detektálható. Ebből arra a következtetésre juthatunk, hogy az előátmenet elsőrendű fázisátmeneti karaktere megváltozott. Ennek oka az lehet, hogy a klórfenol molekulák beépülésével mind a gél, mind a hullámos gél fázisok szerkezete módosul és az azok közötti különbség eltűnik.
77. ábra A DPPC/2,4-diklórfenol/víz rendszer DSC görbéinek a fázisátmenetekhez tartozó kiemelt részletei (1 °C/perc felfűtési sebesség)
A kalorimetrikus mérések után szerkezetvizsgálatokat végeztünk [171,208]. A DCP/DPPC=0.02 arányú rendszer kisszögű röntgenszórását mértük a tiszta rendszer előátmenetére jellemző tartomány alapján három különböző hőmérsékletén: 28°C-on (gél fázis), 30°C-on (átmeneti állapot), és 32°C-on („hullámos” gél fázis). (A választott értékek alacsonyabbak, mint azt a 77. ábra hőmérsékleti tengelye mutatja. Figyelembe vettem a pontos, termodinamikai egyensúlyi helyzetnek megfelelő értékeket, valamint azt is, hogy a DCP hatására a fázisátmenet a kisebb hőmérsékleti értékek irányába tolódik.) A szórási görbék 1. rendű Bragg csúcsainak tartományát a 78. ábrán mutatom be. A reflexió mindhárom hőmérsékleten összetett, azokat a karakterisztikus Lß' és Pß' fázisoknak megfelelő csúcsprofilokra bontottuk szét. A 28°C-on mért összetett csúcsprofilban a gél (Lß') fázisnak megfelelő tag a domináns, ugyanakkor a Pß' fázisnak megfelelő profil is megjelenik, jelezve, hogy 28°C az átmeneti tartományba esik. A 32°C-on mért összetett csúcsprofilban megfordul a két karakterisztikus profil aránya: a Pß' fázis a domináns, és az (Lß') fázis aránya kicsi. A két fázisra jellemző csúcspozíciók eltérnek a tiszta DPPC-víz rendszer értékeitől, ami bizonyítja, hogy a DCP molekulák beépültek a kettősrétegbe és abban változást okoztak. A kisszögű
pure DPPC
T, °C
Endoterm
34 36 38 40 38 40 42
hőmérséklet, T (°C)
Endoterm
0.00004 0.0004 0.004
0.02 0.04
0.00004 0.0004 0.004 0.02 0.04
0 DCP/DPPC 0
előátmenet fő átmenet
diffrakció eredményeit megerősítették a fagyasztvatöréssel kombinált elektronmikroszkópiával, mint független technikával nyert felvételek. A mintát ~30°C-ról kvencseltük a törés hőmérsékletére. A befagyott szerkezeti formák rögzültek és a töréssel feltárt jellemző felületi morfológiák alapján kétféle doméntípust lehetett megkülönböztetni:
sima és hullámos felszínűeket, amelyek a gél és a hullámos gél fázisra jellemzőek. Az eredményt a 79. ábra mutatja. A két felületi karakter típusból a hullámos gél fázisé számszerűsíthető. A felületi hullámok periódusa 24-30 nm között van, ami lényegesen nagyobb, mint a DCP-mentes rendszeré, ami jelzi, hogy a „vendégmolekula” módosítja a Pß'
fázis szerkezetét.
78. ábra A kisszögű diffrakciós görbéjének összetett csúcsprofilja a DPPC-DCP-víz rendszer fázisátmeneti tartományában (0,02 DCP/DPPC mólarány)(T=32°C)
79. ábra A gél és a hullámos gél fázisok együttes előfordulása a 2,4-diklórfenol tartalmú vezikulában (DCP/DPPC=0.02, 30°C)
A DSC eredménye – arra vonatkozóan, hogy a DCP/DPPC=0.02 arányú hidratált DPPC rendszer előátmenetét nem kíséri entalpiaváltozás – nem elégséges bizonyíték arra, hogy DCP jelenlétében az előátmenet folytonos fázisátalakulás (a DSC mérés érzékenysége korlátozott).
A gyengén elsőrendű („majdnem folytonos”) karakter más észleletek alapján is igazolódott. A folytonos fázisátmenetre jellemző megnövekedett fluktuációk, a „frusztrált” állapot következményei mind morfológiailag, mind a rétegszerkezet változásaival tettenérhetők
0,8 1,0 1,2
q (1/nm)
Intenzitás (relatív egység) hullámos gél (Pβ’) fázis gél (Lβ’) fázis
anomális eset : egy harmadik fázis ! összetolt gél fázis
L
β’fázis
P
β’fázis
voltak. A 80. ábra mutatja azokat a lokális és „különleges” formákat, amelyek sem az Lß', sem a Pß' a fázisokra nem jellemzőek.
80. ábra A DPPC-DCP-víz rendszer (2·10-2 mol/mol DCP/DPPC) morfológiája 30°C-on Az 80. ábra baloldali fényképén cső formában feltekeredett alakzat figyelhető meg, amelynek felszínén szögletes, néhol hatszögletes formában kitöredezett részek vannak. S.
Chiruvolu és munkatársai hasonló többrétegű csöves alakzatot figyeltek meg DMPC/geraniol/víz rendszerben (a DMPC a DPPC-hez hasonló lipid: dimirisztoil-foszfatidil-kolin, a geraniol egy elágazó szénláncú, egyértékű alkohol) [209]. Hasonló hatszögletes formák a replikák többi részén is megfigyelhetők voltak. A hatszögletes rész kinagyított formája látható a 80. ábra másik részén. A hatszögek belsejében az anyag szemcsés felszínű, maga a hatszögletes forma felületi mintázatnak látszik. A gyengén elsőrendű karakter következményei konkrét adatok formájában is jelentkeztek. A DCP, lipidre nézve 2 %-os átlagos aránya a fluktuációk és a hibahelyek lokális környezetében megnőtt és szerkezeti változást okozott. A bemutatott, összetett Bragg csúcsok tartalmaznak olyan komponenseket, amelyeknek helyei 5,49 nm (30°C), illetve 56,5 nm (32°C) réteg periódusoknak felelnek meg (78. ábra). Ezek az értékek az összetolt („egymásbatolt”, „összefésült”, „összeépült”, angol kifejezéssel interdigitated) fázis jelenlétét igazolták.
ÖSSZEGZÉS:
A DCP jelenlétében megváltozott fázisátmeneti karakter jelentősége nagy, az amfipatikus lipid molekulák önrendeződését, idegen molekulák hatására bekövetkező szerkezeti változékonyságát teremti meg. Ezek a spontán folyamatok megváltoztatják a sejtmembránképletek érzékenyen lokális szerkezetét, így magát a biológiai folyamatokat is befolyásolják.
A DCP kis koncentrációja által kiváltott hatás megfigyelése (a DCP/lipid arány ~10-5 nagyságrendben van, míg a felhasznált DPPC tisztasága ~99%), tekintettel annak biológiai rendszerekben feltételezett szerepére, további munkákat inspirált és azokról spektroszkópiai területen készültek jelentős közlemények [210–212].
0.22 µm 2 µm
5.2.4 A 2,4-diklórfenol-DPPC-víz rendszer szerkezetének tanulmányozása,