Alapvető szempont az antigén determinánsok hozzáférhetőségének és természetes (natív) térbeli szerkezetének a megőrzése. Ezértkémiai fixálásalkalmazása esetén törekednünk kell arra, hogy alehető legenyhébb(lehetőleg reverzíbilis) kovalens módosítással érjük el a kívánt hatást. A korábban leírt fixálószerek közül ennek a követelménynek aformaldehidfelel meg leginkább. Szép ultrastrukturális megtartás mellett a legtöbb fehérje-antigén immunlokalizációja esetében megfelelő jelölési intenzitást lehet elérni a Karnovsky-fixálócsökkentett koncentrációjú glutáraldehidettartalmazó változataival, amelybe igen gyakran pikrinsavat is tesznek. (A saját gyakorlatunkban nagyon jól bevált rögzítőkeverék összetételét l. a Függelékben).
Azozmium-tetroxidepitop-maszkírozó hatása rendkívül erős. Koncentrációját csökkenthetjük 0,2 %-ig, ekkor azonban már számolnunk kell a membránok gyengébb „megtartásával” és kontrasztjával. Érzékeny antigének esetén teljes elhagyása javasolt.
Arögzítés, avíztelenítésés a beágyazásra felhasználtműgyantatulajdonságai nagyonmeghatározó és szorosan összefüggő tényezőként befolyásolják mind az immunreakció sikerét, mind pedig a biológiai minta finomszerkezetének megőrzését. Egy-egy paraméter megváltoztatása az előkészítő eljárás több pontján is változtatást igényel(het). Az antigenicitás megóvása szempontjából előnyös eljárások – például az enyhe kémiai fixálás és az ozmifikálás elhagyása – sokkal érzékenyebbé teszik a szövetet a dehidrálás és beágyazás során fellépő extrakciós (kioldódási) és denaturációs (kicsapódási) hatásokra.
Ezen problémák elkerülésének egyik lehetséges (és igen hatékony) módja, ha – a fixálástól a víztelenítésen át a műgyantába történő beágyazásig – az egész minta-előkészítési protokoll alacsony hőmérsékleten zajlik. A transzmissziós elektronmikroszkópiában általánosan elterjedt epoxigyanták azonban nagyon korlátozottan alkalmazhatók ilyen körülmények között. Olyan műgyanták kifejlesztésére volt szükség tehát, amelyek alacsony hőmérsékleten (akár -20 °C) is jól átitatják a beágyazandó mintát, és polimerizációjukhoz (megszilárdulásukhoz) nincs szükség magas hőmérsékletre, az kiváltható UV megvilágítással is. A korszerűakriltípusú műgyanták megfelelnek ezeknek a követelményeknek. Közülük leginkább elterjedtté az LR White használata vált.
Az ultravékony metszetek felszínén zajló post-embedding immuncitokémiai jelölés eredményessége szempontjából különösen előnyös ezen műgyanták (enyhe)hidrofil tulajdonsága. Amellett ugyanis, hogy a beágyazás során elkerülhető a minták 100%-os víztelenítése, és ezzel csökkenthető az antigének károsodása, illetve az extrakció, a metszetek részleges rehidrálásával jelentősen fokozni lehet az antigén–antitest reakció intenzitását is.
Mindezek után érthető, hogy mind az ultrastruktúra, mind pedig az antigenicitás megőrzését szem előtt tartó, nagyon kíméletes minta-előkészítési eljárás azalacsony hőmérsékleten végzett fixálás és beágyazás(angolul:
cryo-fixation, freeze substitution), amelynek lényege a következő.
Az alacsony hőmérsékleten végzett fixálási eljárások közé tartozik amagas nyomású fagyasztás(high-pressure freezing), amelyről korábbiakban már említést tettünk (l. Minta-előkészítés rutin TEM vizsgálatokra, Anyagpreparálás, rögzítés c. fejezet). Ez speciális és igen drága berendezést igényel.Ennek hiányábana rögzítéshez
a fent említett rögzítőkeveréket használhatjuk (pontos összetételét l. Függelék). A mintát alacsony hőmérsékletre helyezése előtt cukoroldattal átitatjuk (krioprotekció9), majd folyékony nitrogénben lefagyasztjuk (-190 °C).
Hidrofil beágyazószer (LR White) esetében a szövetet csak részlegesen kell dehidrálni, ezért azt tömény alkoholba helyezzük, s -70 °C-ra tesszük. Ezt követi a szervdarabka folyékony beágyazószerrel való átitatása és beágyazása, mégpedig alacsony hőmérsékleten (-20 °C). Ilyen körülmények között a beágyazószer polimerizációját UV megvilágítással biztosíthatjuk. Ezen eljárás során nincsen szükség ozmiumos utófixálásra és blokk-kontrasztozásra, nehézfémsókkal csak a blokkból készített ultravékony metszeteket kezeljük. Egy ilyen eljárással készített mintát láthatunk a 4.54. ábrán.
4.54. ábra.Immunarany jelölés multivezikuláris test membránján (alacsony hőmérsékletű fixálás és beágyazás, LR White beágyazás, mannóz-6 foszfát kimutatás)
Metszés
A beágyazás utáni immunjelölés egész folyamata a metszetet hordozó rostélyra (grid) felvett ultravékony metszetek felszínén zajlik, ezért a metszetek minősége kritikus szempont. A kívánt minőségű metszet elkészítésének nélkülözhetetlen eszköze a hibátlan és tiszta kés, ami készülhet üvegből is, de a megfelelően gondozottgyémántkés nagyságrendekkel tartósabb, és nagyobb felület egyenletes vastagságú metszésére alkalmas. A viszonylag hosszadalmas és több inkubációs lépésből álló post-embedding jelöléshez (l. 4.51. és 4.52. ábra) a hagyományos elektronmikroszkópos vizsgálatra készült, 50–60 nm-nél vastagabb,80–100 nm-es metszetekre van szükség (4.28.
ábra).
Az igazán jó metszet felszíne úgy néz ki, mint egy finoman faragott dombormű, aminek a legmagasabb és legalacsonyabb pontja között 10–15 nm szintkülönbség van (4.50. ábra). Miután sem a primer, sem az arannyal konjugált másodlagos ellenanyagok nem tudnak a polimerizált műgyantával átitatott metszet belsejébe hatolni (penetrálni), ezért az antigén–antitest reakció csak erre a rétegre koncentrálódik. Ebből adódik, hogy az antigéneknek csak azokat a determinánsait tudjuk megjelölni, amelyek ebbe a domborművi felszínbe belekerültek.
A többiek rejtve maradnak az antitestek számára. (A korábban leírtak mellett ez az alapvető magyarázata annak, hogy post-embedding jelölés során a monospecifikus – az antigénnek csak egyetlenféle epitopját felismerő – monoklonális antiszérumok alkalmazása általában miért jár szerény eredménnyel.)
Különböző maratási technikákkal (etching) a domdorművi felszín mélyíthető (4.50. ábra), sőt a műgyanta teljesen ki is oldható a metszetből, de ezek az eljárások többnyire a minta jelentős morfológiai károsodásával, és esetenként az antigének migrációjával is járnak.
A jól kivitelezett eljárás végén a mikroszkópban látható képen a jelölés egyértelmű, a háttér (aspecifikus jel) szintje alacsony, az aranyszemcsék jelenléte a jelölt struktúrához köthető, miközben a sejt ultrastruktúrája jó megtartású és a kontraszt is megfelelő ahhoz, hogy a sejtalkotókat azonosíthassuk (4.55., 4.56. ábra).
9A cukor akadályozza a jégkristályok kialakulását.
4.55. ábra.Gliális filamentumokat képző savas fehérje (GFAP) kimutatása glia (asztrocita) sejtben. Az aranyszemcsék egyértelműen a kötegeket képező, vékony vonalakként megjelenő intermedier filamentumokat
jelölik, a szabad citoszolikus területről hiányoznak.
4.56. ábra.Zimogén granulumok egyik specifikus fehérjéjének (tripszinogén) kimutatása immunjelöléssel (hasnyálmirigysejt). Az aranyszemcsék zöme a sötétszürke árnyalatú granulumokban csoportosul, de néhány
szemcse a citoplazmában is felbukkan (háttér)