Az eljárás elnevezése azt jelzi, hogy a rutinszerűen alkalmazott kontrasztosítással (világos háttér, sötét objektumok) szemben az így kapott képen aháttér sötét(elektronszóró) lesz, avizsgált objektum pedig világos(elektronok számára átjárható). Emlékeztetőül: a biológiai minták alapvetően transzparensek, rajtuk az elektronok nem szóródnak, tehát ha nehézfémek nem kapcsolódnak hozzájuk, akkor az elektronsugarak kölcsönhatás nélkül áthatolnak rajtuk (4.1. és 4.2.ábra).
Az eljárás népszerű, mert gyors, egyszerű módszer izolált sejtalkotók (ultracentrifugálással nyert frakciók), baktériumok, vírusok és makromolekulák (sejtváz elemek, fehérje aggregátumok) vizsgálatára. A munka során a vizsgálandó objektumokat tartalmazó oldatot hártyás rostélyra kell kicseppenteni és arra rászárítani.
A módszer lényege, hogy a vizsgálandó objektumra nehézfémsó oldatot cseppentünk, ami kitölti a preparátum mélyedéseit és az objektumok közötti teret, ám a minta magasabb részeit nem lepi el, így azok kontrasztanyagmentesek lesznek. A gyorsan beszáradó fémsóoldat elektronszóróvá teszi a környezetet, míg a
„kiálló” részek transzparensek maradnak, tehát a képen fehér színűek lesznek (4.44., 4.45.A ábra).
4.44. ábra.A pozitív (A) és a negatív (B) kontrasztozási eljárás lényege: a pozitív eljárásnál a nehézfémsók a biológiai minta egyes komponenseihez kötődnek, a negatív „festésnél” az azok közötti teret töltik ki; felül oldalnézeti
kép, alul a mikroszkópban megjelenő kép
Ha a kontraszt anyagot megfelelően adagoljuk, vagy óvatosan kissé lemossuk, akkor az szinte csak a minta finom mélyedéseiben, a kiemelkedő részek peremén ül meg, illetve marad meg, így annak térbeli, domborzati viszonyait kirajzolja (4.45.B ábra).
4.45. ábra.Csavarodott fonalakat (helikális filamentumokat) formáló fehérjeaggregátumok negatív kontrasztozás után: a B minta készítése során a kontrasztanyagot annak beszáradása előtt óvatosan leöblítettük, így itt a háttér
világos (tau-filamentumok Alzheimer-kórban elhunyt beteg agymintájából)
Citokémia
Alapjai megegyeznek a korábbiakban már bemutatott hisztokémiai eljárások alapjaival. A fénymikroszkópos metszetekhez hasonlóan az ultravékony, elektronmikroszkópos metszeteken is láthatóvá tehetjük specifikus komponensek jelenlétét, azaz a lipidek, szénhidrátok, nukleinsavak és fehérjék kimutatására kidolgozott hisztokémiai (szövettani) eljárások közül – némi módosítással – egyeseket az elektronmikroszkópiában is használhatunk.
Ilyenre példa a Feulgen- és a PAS-rakció. Nehézfémionok nem csak lipidrétegeket (l. kontrasztosítás), hanem szénhidrátokat is jelöl(het)nek (l. sejtköpeny).
Ha a feladat fehérjék kimutatása, választhatunk immunológiai módszert: a fehérjét (antigén) specifikusan felismerő ellenanyaggal jelöljük, majd ezt az immunkomplexet mutatjuk ki. A módszer a keresett fehérje lokalizációjára alkalmas, és többféle változata ismert (l. Immuncitokémia).
Amennyiben a fehérje enzim, akkor a helyzetén kívül aműködésérevonatkozóan is nyerhetünk információt, hiszen az enzimeket katalizált reakcióik alapján azonosíthatjuk. Ezzel foglalkozik az enzimcitokémia.
Alkalmazásának feltétele, hogy az enzim megőrizze, illetve visszanyerje aktivitását az eljárás során – ezt a szempontot a minta-előkészítő eljárás egésze folyamán szem előtt kell tartani.
Azenzimcitokémia alapjaaz, hogy az adott enzimreakció termékei (vagy azok egyike) olyan reakcióba vihetők, amelyben belőlük a keletkezésük, vagyis az enzim aktivitásának helyén azonnaloldhatatlan csapadékkeletkezik.
Amennyiben a végtermék nehézfémionokat tartalmaz, az enzimaktivitás elektronmikroszkópos metszeten is detektálható. A korábban már bemutatottGömöri-féle savas foszfatáz kimutatásilyen eljárás: a reagensek között ólom-nitrát is szerepel, amely a savas környezetben aktív foszfatáz által lehasított foszforsavmaradékkal elektronszóró ólom-hidrogén-foszfát csapadékot képez. A reakció a lizoszomális enzimek kimutatására alkalmas, eredményeként a képen sötét folt jelenik meg ott, ahol az enzim működött (4.46. ábra). A lúgos foszfatáz kimutatás során keletkező kobalt-szulfid csapadék szintén azonosítható elektronmikroszkópban.
4.46. ábra.Lizoszomális enzimaktivitás savas foszfatáz kimutatáson alapuló azonosítása: a fekete csapadék autofagoszóma lizoszómával való fúzióját bizonyítja
A műtermékek képződési lehetősége (pl. az elégtelen fixálás miatt az enzim nem eredeti helyen való előfordulása, az aktivitás elvesztése, a szubsztrát nem megfelelő volta és bomlékonysága, a csapadék részleges kioldódása) miatt a kapott eredmény csak megfelelő kontrollkísérletek elvégzésével fogadható el.
Immuncitokémia
Az alapok
Ahogy azt már korábban írtuk, az elektronmikroszkópia megjelenése új távlatokat nyitott a morfológiai vizsgálatok előtt. Az egyre újabb és újabb generációs mikroszkópok az élőlények szerkezeti felépítésének (struktúrájának) egyre részletgazdagabb tanulmányozását és leírását teszik lehetővé, amely ma már a makromolekulák szintjénél tart. (A jelen technikák az atomi szintű felbontást is biztosítják /l. nagy felbontású transzmissziós és pásztázó elektronmikroszkóp, HR-T(S)EM/, de ennek gyakorlati jelentősége csak az élettelen minták, kristályok szerkezetének kutatásában van.)
Ahhoz, hogy a szerkezet és a működés kapcsolatáról és ennek változásáról molekuláris szintű ismereteket szerezzünk, arra van szükség, hogy a makromolekulák eloszlási mintázatát a szöveti szint mellett (l. fénymikroszkópos immunhisztokémia, angolul immunohistochemistry, IHC) a sejtek szintjén is vizsgálni tudjuk. A sejten belüli, ún.
ultrastrukturális lokalizáció vizsgálatára az elektronmikroszkópos immuncitokémia (angol nevén:
immunocytochemistry,ICC) módszertana teremt lehetőséget, amely az elektronmikroszkópiát a nagy felbontású, de mégis csak leíró, szerkezetvizsgáló módszerből a molekuláris sejtbiológia ma is dinamikusan fejlődő ágává tette.
Azimmuncitokémia alapjaiazonosak az immunhisztokémia alapjaival: a módszer a nagyonspecifikus antigén-antitest reakcióra épül, ahol a lokalizálandó antigén alapvetően fehérje. A kivitelezés során alkalmazandó módszertani különbségek elsősorban abból az igényből származnak, hogy szeretnénk kihasználni az elektronmikroszkópnak a fénymikroszkópét nagyságrendekkel meghaladó felbontóképességét. Így e módszernél a cél az, hogy az antitest által felismert antigént annak természetes előfordulási helyén(in situ) tegyük az elektronmikroszkópban– minden más struktúrától megkülönböztethető módon –láthatóvá.
Mindezen szempontokat figyelembe véve egy molekuláris szinten értelmezhető és képi mondanivalóban gazdag elektronmikroszkópos immunjelölés sikeres kivitelezésénekhárom alapvető feltételevan:
1. jó minőségű, rendkívülspecifikus ellenanyag;
2. elektron-optikailag kiválóan detektálhatójelzőanyag(vizualizációs marker);
3. megfelelő – sokszor a mintára szabott, egyedi – minta-előkészítés, amelynek kettős követelményt kell kielégítenie: maximálisan kell biztosítania
a. a lokalizálandó fehérje antigenicitásának természetes formában való megőrzését, valamint b. a biológiai minta finomszerkezetének (ultrastruktúrájának) a lehető legjobb megtartását.
A minta-előkészítés fenti két (3.a és 3.b) követelményénekegyidejű teljesítéseigennagy nehézségekbe ütközik, és soha nem lehet tökéletes. A rutin TEM eljárások során használt, jó megtartást biztosító fixálók változatlan módon való alkalmazása ugyanis – kovalens keresztkötések kialakításával – gyakran tönkreteszi az epitopokat4, így ellehetetleníti a jelölést. Az antigén determinánsok épségének, reakcióképességének a megvédését szolgáló eljárások pedig általában nem biztosítják kellő mértékben az ultrastrukturális szerkezetek megőrzését. A kidolgozott eljárásokban tehátkompromisszumok sorozatát találjuk, hiszen azok „egyensúlyoznak” a két feltételt külön-külön maximálisan biztosító megoldások között.
Ellenanyagok
Az ellenanyagok szerkezetével, előállításával, tisztításával és minőségük ellenőrzésének módjaival e könyv keretein belül nem foglalkozunk. Az Immunhisztokémia fejezetben leírt alapokon túl, alább röviden összefoglaljuk a poliklonális antiszérumokés amonoklonális ellenanyagokközötti alapvető különbségeket.
Amikor egy állat immunrendszere találkozik egy számára „idegen” fehérjével (az immunizálás során beoltott antigénnel), akkor benne több B-limfocita klón jön létre, amelyek mindegyike az antigénnel szemben specifikus immunglobulint termel. Az egyes klónok abban különböznek, hogy ellenanyaguk az antigén mely részletét (epitopját) ismeri fel, s azt milyen affinitással és specificitással köti. A vérszérumban tehát több klón terméke azonosítható, ezért ezt a szérumotpoliklonális antiszérumnak nevezzük.
Amikor egy olyan ellenanyagot szeretnénk, amely „tiszta” abban az értelemben, hogy az antigénnek csak egy szigorúan meghatározott epitopját (részletét) ismeri fel, akkor válogatni kell a keletkező klónok immunglobulinjai között. Ezt megtehetjük a poliklonális antiszérumból kiindulva: a módszer neve affinitástisztítás, s hozzá nagy mennyiségű antiszérum és antigén szükséges. Egyszerűbb megoldás, ha még a B-sejt klónok közül választjuk ki a legmegfelelőbb immunglobulint termelőt, majd ezt a klónt egy B-sejthiányos állat hasüregfolyadékában felszaporítjuk. Az így kapott reagens tehát nem a vérből származik (nem vérszérum), s csak egy klón ellenanyagát tartalmazza, tehátmonoklonális5.
Számtalan tapasztalaton alapuló általános szabály, hogy csak olyan ellenanyaggal vágjunk bele elektronmikroszkópos jelölésbe, amelyet fénymikroszkópos szinten már teszteltünk, és a jelölés intenzitása és
4Az epitopok, vagy más néven antigén-determinánsok az antigén olyan – többnyire néhány aminosavból álló – meghatározott szerkezetű részletei, amelyek kizárólagosan jellemzik az adott antigént.
5További részleteket és hátteret l. az immunológiai tankönyvekben.
specificitása egyaránt megfelelő volt. A precíz kivitelezés ellenére azonban a siker ekkor sem garantált, főleg, ha a lokalizálandó antigén (fehérje) fokozottan érzékeny az immunreakciót megelőző minta-előkészítő eljárás valamelyik lépésére.
Elvileg mind a poli-, mind pedig a monoklonális ellenanyagok alkalmasak elektronmikroszkópos immunjelölésre.
A tapasztalat azonban azt bizonyítja, hogy amonoklonális ellenanyagok alkalmazási köre jóval korlátozottabb.
Ennek magyarázata abban rejlik, hogy az immunglobulin az antigénnek csak egyetlen antigén determinánsát ismeri fel (l. feljebb). Amennyiben ennek hozzáférhetősége a minta-előkészítés következtében gyengül vagy megszűnik (a jelenség neveantigénmaszkírozás), illetve az eljárás során rejtve marad, akkor megtévesztő negatív eredményt kapunk. Ez a magyarázata annak, hogy a monoklonális ellenanyagokat általában csak az úgynevezett beágyazás előtti (angolul: pre-embedding) immunjelöléshez használjuk, ahol a minta-előkészítés során sokkal kisebb mértékben áll fenn az antigénmaszkírozás veszélye.