Azélő szervezetből kiemeltminta nagyon gyorsan változik, lebomlik. Ennek megakadályozása érdekében kellő körültekintéssel, de gyorsan, célzott mozdulatokkal kell dolgoznunk. A vizsgálandó szervet (vagy szervrészletet) rögzíteni, fixálni kell, azaz az azt felépítő struktúrátaz élő állapothoz legközelebbi helyen és állapotban kell megőrizni. A rögzítés fokozza a minta további eljárások – esetleges károsító – hatásaival szembeni ellenálló képességét is.
Gyakorlati tapasztalat, hogy olyan fixáló nincsen, amely minden szempontból megfelelő lenne, ezért olyan rögzítőoldatot és eljárást kell alkalmaznunk, amelyik a legkevesebb műtermék megjelenésével jár. Általános tanács, hogy előkísérletként több lehetőséget is érdemes kipróbálni, s a hasonló eredményt adók közül a legjobbat kell kiválasztani.
A munkához olyan kémiai fixálók az ideálisak, amelyek beépülnek a sejt molekuláris rendszerébe, s így fejtik ki hatásukat.
A fixálók másik csoportja kicsapja a fehérjéket, így megváltoztatja azok alakját, tönkreteszi a szerkezetet, általában térfogatváltozást, zsugorodást okoz (ilyen pl. az etil-alkohol).
A minta eredeti állapotban való megőrzésének igénye miatt nagyon fontos a fixálóoldat megfelelő pH-jának, ionösszetételének, ozmolaritásának és hőmérsékletének megválasztása. Arögzítőszer és a szövet kölcsönösen hatnak egymásra: amíg a fixáló bejut a szövetbe, annak anyagai is kijuthatnak a rögzítőoldatba, megváltoztatva annak összetételét. Nyilvánvaló, hogy az élő szervezetet „utánzó” környezet megteremtése csaktöbbkomponensű rögzítőoldattal lehetséges. A legmegfelelőbb környezetet a fixálók és az ún. hordozóoldatok összetételének optimális megválasztásával tudjuk biztosítani (l. még alább).
Vegyük tehát sorra a rögzítőoldatok egyes összetevőit a fixálóoldatokkal szemben támasztott követelmények szerint!
Aleggyakrabban használt kémiai fixálók:a glutáraldehid, a formaldehid és az ozmium-tetroxid (4.18. ábra).
Mivel az aldehidgyök (–COH) igen sokféle funkciós csoporttal képes kapcsolatba lépni, az aldehid típusú fixálók keresztkötéseket alakítanak ki a fehérjék között és a fehérjemolekulákon belül is. A keresztkötéseknek fontos szerepük van abban, hogy a makromolekulák eredeti helyükön maradjanak, azaz ne oldódjanak ki a beágyazási eljárás során.
Aformaldehid(HCOH) előnyös tulajdonsága, hogy gyorsan és mélyen behatol (penetrál) a mintába. Vizes oldatban metilénglikol (H2C–(OH)2) formájában van jelen, amelyből pozitív töltésű, nagyon reaktív gyökök keletkeznek.
E formákból végül is olyan metiléncsoportok lesznek, amelyek két fehérjemolekula között kereszthídként azonosíthatók (R–CH2–R’, 4.18.D–F ábra). Mivel ezek a kapcsolatokreverzíbilisek – a fixálás utáni lépésben (a fixáló kimosása során) részlegesen hidratálódhatnak, azaz felbomolhatnak –, ezért ez a fixáló a rutin elektronmikroszkópos célokra önmagában nem elég hatékony. Akkor azonban, amikor a fixált fehérjék biológiai aktivitásának (térszerkezetének) megtartása fontos követelmény (enzim- és immuncitokémiai vizsgálatok), kifejezetten ajánlott.
A formaldehid ma már ampullázott, nagyon tiszta, stabil, 16%-os oldat formájában kapható. A stabilitás azt jelenti, hogy az oldatban gyakorlatilag nem képződik dimerizált forma, azaz paraformaldehid (PFA).(Utóbbi mennyiségének növekedése nyilvánvalóan csökkenti a fixálás hatékonyságát.)
A glutáraldehid(HOC–(CH2)3–COH, 4.18.B ábra) az anyagba lassabban hatol be (nagyobb méretű, mint a formaldehid), de hatékonyabban (irreverzíbilis módon) hoz létre keresztkötéseket, mint a kisebb formaldehid. A fehérjéket jól rögzíti, a lipidekkel viszont nem lép reakcióba. Az elektronmikroszkópos rögzítéshez desztillálással kapott ampullázott oldatát ajánljuk, mivel ebben a szennyeződések (glutársav, etanol, metanol, dimer és oligomer formák) mennyisége elhanyagolható. Eltarthatóságát a polimerizációja korlátozza: az eredetileg víztiszta oldat sárgulni kezd, ha a glutáraldehid molekulák kovalensen egymáshoz kapcsolódnak.
A rutin eljárások során ma már a formaldehid és a glutáraldehid különböző arányú elegyét használják (l.
Karnovsky-fixáló), a rögzítőkeverékben ugyanis mindkét komponens előnyös hatása érvényesül: a gyorsan penetráló formaldehid megfelelő, de nem tartós rögzítőhatását a lassabban behatoló glutáraldehid véglegessé, irreverzíbilissé teszi.
Azozmium-tetroxid(4.18.C ábra) a rögzítőhatását annak köszönheti, hogy reakcióba lép a lipidek kettős kötéseivel (keresztkötéseket alakít ki közöttük), illetve egyes poláros csoportjaival (ezeket adott fehérjékhez köti).Önmagában alkalmazva nem elég hatékony, mert egyes anyagokat nem képes azok eredeti helyén megőrizni, még glutáraldehid után használva is tapasztalható, hogy a lipidek kb. 10%-a kioldódik a mintából, s a fehérjék egy része is távozik a sejtből. Ezek a káros hatások alacsony hőmérsékleten kisebbek, ezért ajánlott 4 °C-on használni. A lipideket érintő veszteség tovább csökkenthető, ha a fixálóoldatbankálcium(-klorid) is jelen van. A fixálás idejét az befolyásolja, hogy az ozmium-tetroxid által rögzített szövetrész gátat képez a fixáló további penetrációjával szemben, azaz a rögzítőszer szövetbe történő behatolása egyre inkább lassul.
4.18. ábra.Az elektronmikroszkópiában leggyakrabban használt rögzítők: formaldehid (A), glutáraldehid (B) és ozmium-tetroxid (C). Metilén-glikol (D), köztes, reaktív termékek (E) és keresztkötések kialakítása (F) (R és R’:
szerves molekulák)
Az ozmium-tetroxidot a rutineljárás során – aldehides fixálás után– utófixálókéntés kontrasztosítóként használjuk (0,5–1%-os koncentrációban); ilyenkor nem szükséges alacsony hőmérsékleten alkalmazni. Aldehides fixálók utáni használatát a membránokat megőrző tulajdonsága indokolja, amivel jelentősen mérsékli a beágyazást megelőző víztelenítési lépések során az etil-alkohol lipidveszteséget okozó hatását.
Az ozmium-tetroxid illékony és toxikus vegyület, a bőrre, a szembe, orrba, torokba jutva ártalmas! Ampullázva, kristályos formában kapható. Nagy körültekintéssel készített, bomlékony és illékony odatát sötétben, hűtőszekrényben kell tartani. A vele való munkát kizárólag elszívófülkében, laboratóriumi gumikesztyűt viselve végezzük!
Ahordozóoldatoklehetővé teszik a fixáló pH-jának és ozmolaritásának stabilizálását. Ezek olyanpufferrendszerek, amelyek komponenseitől elvárjuk, hogy vízben jól oldódjanak, ne befolyásolják a kémiai fixálószer hatását (azzal ne lépjenek reakcióba), a disszociáció mértéke gyakorlatilag ne függjön a koncentrációjuktól és a hőmérséklettől, s a rendszer pufferelési tartománya pH 6 és 8 közé essen. Gyakorlati tapasztalat, hogy ugyanazon fixáló más és más pufferrendszerben kissé eltérő ultrastruktúrát ad (a kísérletben alkalmazott puffer ismerete tehát fontos az eredmények kiértékelésekor).
Az elektronmikroszkópos mikrotechnikában a legáltalánosabban elterjedt puffer a kakodilát puffer, amelyet 6,4–7,4 közötti pH-tartományban használnak. Hosszan eltartható oldatát nátrium-kakodilátból [Na(CH3)2AsO2x 3H2O] és koncentrált sósavból állítják elő. Mivel hamarabb hat a sejtekre, mint a fixáló, ezért membránkárosodást is okozhat, amit azonban – a membránokat stabilizáló hatású – kalcium hozzáadásával megelőzhetünk. Előnyös tulajdonsága, hogy segítségével számos enzim aktivitását részlegesen megőrizhetjük.
Arzéntartalma miatt mérgező, bőrgyulladást okozhat, belélegezni sem ajánlott: elszívófülke alatt, gumikesztyűt viselve dolgozzunk vele!
Afoszfátpufferek(l. Sörensen puffer) ugyan a legtermészetesebb hordozóoldatok lennének (fiziológiásak), de csapadékot képezneka kontrasztosítás során használt ólom- és uránsókkal, valamint a kalciummal (kalcium-foszfát). Ezért ha a fixálás során foszfátpuffert használunk, akkor azt a rögzítés után, a víztelenítés megkezdése előtt gondosan el kell távolítani (alaposan „ki kell mosni”) a mintából.
A foszfátpufferek kalcium-foszfátképző tulajdonságát adott esetben ki is használhatjuk: ha a minta valamely komponense nagy mennyiségű kalciumot köt (pl. miozin), annak kontrasztját növelni fogja. Az eljárás további menetét azonban ennek a csapadéknak a megőrzéséhez kell igazítani (a víztelenítést 50%-os etanollal kell kezdeni), s a kapott kép kiértékelésénél az esetleges műtermékek megjelenésének lehetőségét figyelembe kell venni.
A rutinvizsgálatoknál az elektronmikroszkópos mikrotechnikában a szerves pufferek (pl. HEPES, PIPES) használata nem vált általánossá.
A hordozóoldatok következő lényeges összetevője azozmolaritást meghatározó komponens. A sejtek alakja és mérete egyértelműen függ az intra- és az extracelluláris térben uralkodó ozmotikus koncentrációk különbségétől.
A fixálóoldat először az extracelluláris térben jelenik meg. Amennyiben ozmotikus koncentrációja eltér a sejt közötti folyadéktérétől, akkor az az anyagoknak a sejtből történő kioldódását vagy az extracelluláris folyadék káros mértékű beáramlását eredményezheti. Ez a lassan ható fixálók esetében jelentős műtermékképződéshez vezethet.
A tényleges ozmotikus nyomást azok a komponensek alakítják ki, amelyek nem jutnak át szabadon a membránokon.
Ebből a szempontból a hordozóoldatok (pufferrendszerek) komponensei lényegesebbek, mint maga a fixáló. Az ozmolaritás beállítására használt adalékanyag lehet töltéshordozó elektrolit és töltéseket nem hordozó, nem-elektrolit jellegű molekula.
Azelektrolitok, pl. akalcium-klorid, csökkentik a sejtalkotók duzzadását, stabilizálják a membránokat, csökkentik az anyagveszteséget. Mivel kicsapják a fehérjéket, használatuk csak nagyon alacsony koncentrációban ajánlott.
Nem-elektrolit adalékok például a glukóz, a szukróz és a dextrán, amelyek az anyagmegőrzésben szintén eredményesen alkalmazhatók.
A megfelelő fixáló kiválasztásán kívül afixálás módjának is döntő szerepe van. Az ultramikrotechnikában az immerziós fixálás helyettkombinált fixálást alkalmaznak: első lépésbenperfúziós fixálást, majd ezt követően immerziós módszert.
Ahogy ezt a korábbiakban írtuk, ez röviden azt jelenti, hogy a vizsgálatra kiválasztott szervet „belülről”, az érrendszere felől rögzítjük. Az elaltatott állat szívébe vagy a nagy artériák közül valamelyikbe (általában az aorta valamelyik szakaszába) kanült vezetünk, majd a vénás rendszert megnyitjuk (valamelyik nagyvénát átvágjuk), és az érrendszert először fiziológiás sóoldattal vagy izotóniás pufferrel átmossuk. Amikor a vért már kimostuk, a sóoldatot fokozatosan lecseréljük a rögzítőszert tartalmazó oldatra. A fixáló így a szervezetben eredeti helyén lévő szervet rögzíti, amelyet azután nagyobb biztonsággal távolíthatunk el, mint „friss” állapotában. (Egy ilyen előfixált szervet a mechanikai hatások [csipesz!] kevésbé károsítanak.)
A szervezetből kiemelt szervet ezutánimmerziós módszerrel utófixáljuk az ismert módon. Ehhez a kiemelt szervből olyan kisméretű darabokat kell kivágni, amelyek vastagsága 0,5–0,75 mm közötti. Ezeket előre feliratozott, megfelelő térfogatú, hűtött fixálót tartalmazó, jól zárható (pl. gumidugós) üvegcsékbe helyezzük, s a rögzítés időtartamára hűtőszekrényben tartjuk.
A megfelelő fixálás idejét tapasztalati úton határozhatjuk meg. Arögzítés végéna fixálóoldatot a hordozóként használt pufferoldatra cseréljük le annak érdekében, hogy afixáló feleslegét kimossuka mintából. A továbbra is hűtőben tartott blokkokon a pufferoldatot többször is le kell cserélni.
Tökéletes fixáló nincsen: a hagyományos fixálók alkalmazása gyakran vezet(het) műtermék képződéséhez (ilyen a fehérje-összecsapzódás, a membrándeformáció, a zsugorodás és a duzzadás). Modern, nagyon szép eredményeket adó alternatív eljárás a minta gyors lefagyasztása, amely során a jégkristályok képződését megakadályozzuk.
Köztudott, hogy a jéggé fagyott víz térfogata nagyobb, mint a folyékony halmazállapoté, s a kialakuló kristályok roncsolják a membránokat. A kristályosodás megakadályozható igen nagy (kb. 2000 bar) nyomás és alacsony hőmérséklet (-70–90 °C) alkalmazásával. A módszer neve magas nyomású fagyasztás (high-pressure freezing).
Ha e lehűtés megfelelően gyors, a vízben nem alakulnak ki kristályosodási magok, a molekulák nem rendeződnek kristályos szerkezetbe – a túlhűtött víz folyadék marad. A módszer alkalmazásának a minta (blokk) nagysága szab határt (azon idő alatt, ami az áthűtéséhez szükséges, a belsejében van-e idő jégkristályok képződésére). A rutinvizsgálatokon kívül kifejezetten ajánlott immunológiai jelölések előtti alkalmazása (l. immuncitokémia). Az eljárásról az irodalomban több összefoglaló is megjelent2.