Az öntőformából kivett blokkok felszínét a metszéshez elő kell készíteni. Ultravékony metszeteket csak kb.1 mm2 nagyságú felületről lehet eredményesen és szépen készíteni. Ezért a blokkok csúcsi részét megfelelően ki kell alakítani: olyan csonka piramis formát kell a minta felett képezni, amelynek oldalai közrefogják a mintát, felszíne trapézvagy (nagyobb metszetek szükségessége esetén)téglalapalakú, és közvetlenül a beágyazott anyag fölött van.
A munkához a blokkot egy blokkbefogóba helyezzük, majd sztereomikroszkóp alatt a felesleges műgyantát pengével lefaragjuk róla. A blokk kifaragását a piramis oldalainak kialakításával kezdjük, majd a tetejét vágjuk le megfelelő magasságban egyélű pengével (4.24. ábra). Ezután Gillette pengével lesimítjuk a piramis tetejét (4.25.A ábra), majd a blokkot áthelyezzük a mikrotóm tárgy- vagy más néven blokkbefogójába (4.26. és 4.27. ábra).
4.24. ábra.A blokk kifaragásához szükséges eszközök: blokkbefogó a befogott blokkal (A), egyélű penge (B), Gillette penge (C) és a kifaragott blokk (D). A beágyazott minták az ozmiumkezelés miatt sötétek és jól látszanak
4.25. ábra.Téglalap alakúra kifaragott (A) és már metszett (B) blokk felszíne (a beágyazott minták az ozmiumkezelés miatt sötétek)
Az ultravékony metszetek készítésére kifejlesztett eszköz az ultramikrotom. Felépítése a fénymikroszkópos metszetek készítésére használt kerekes mikrotomhoz hasonló: a kés helyzete rögzített, a metszés során a blokk mozog fentről lefelé. Működéseautomatizált, de a metszetek lehúzása (lendkerék segítségével) manuálisan is végezhető. A munkát a tárgy- és késbefogó fölé szerelt mikroszkóppal folyamatosan ellenőrizhetjük (4.26. ábra).
4.26. ábra.Újabb (A) és régebbi típusú (B) ultramikrotomok
A blokk fentről lefelé halad, miközben a rögzített kés pengéje egy metszetet szel le a felszínéről. A kés előtt elhaladt blokk a kés mögé süllyed (ez a metszési fázis vége, 4.27. és 4.28. ábra jobb oldali kép), majd felemelkedve visszatér kiindulási helyzetébe (visszatérési fázis), miközben egy nagyon precíz szerkezet gondoskodik az előretolásáról: a blokk felszíne egy cikluson belül a metszet kívánt vastagságának megfelelő mértékben mozdul előre.
4.27. ábra.A mikrotomba befogott gyémántkés és a blokk metszés közben (oldalról [A] és szemből [B] nézve):
a blokk éppen a metszési fázis végére, a kés mögé ért
A lehúzott és a kés víztartó medencéjébe úszómetszetek vastagságát a mikrotom saját megvilágítása mellett, azok színe alapján lehet ellenőrizni. A rutinjellegű TEM vizsgálatokra az ezüstszürke, immunjelölésre (l.
Immuncitokémia fejezet) pedig egy kicsit vastagabb, aranyszínű metszetek a legalkalmasabbak (4.28. ábra).
4.28. ábra.Bal oldalon a metszetek vastagságának és színének összefüggése; a jobb oldalon: metszetek a gyémántkés medencéjének vízfelszínén (a bal oldali, szivárványos metszetek kisimítatlanok, a medence közepén lévők aranyszínű,
kisimított, immunjelölés céljára készített, nagyméretű, egymástól elváló metszetek)
A vízfelszínen úszó metszetek kisimítása kloroform- vagy xilolgőzben, vagy hőceruzával történik. A metszetek fölött a szerves oldószerbe mártott fogpiszkálót vagy abba áztatott szűrőpapírcsíkot, illetve hőceruzát húzunk el vagy tartunk (ezek a kezelések a felületi feszültséget növelve segítik a metszetek kisimulását, l. 4.28. ábra jobb oldali kép). A következő lépés a metszetek mikrorostélyra (4.29. és 4.30.ábra), majd a rostély számmal és betűjelekkel ellátott metszettartó dobozba (gridtartóba) való helyezése. A metszeteket könnyebb a rostélyra telepíteni, ha a metszés során sorozatot, szalagot alkotnak (párhuzamos éleikkel összetapadnak), s nem úsznak el egymástól.
4.29. ábra.Mikrorostély nagy nagyítású képe a metszetekkel
4.30. ábra.Metszetek a rostélyon (kis nagyítású elektronmikroszkópos felvétel): A: a metszés során sorozatban lejövő, ép metszetek, B: szakadozott, tönkrement metszetek (a minta-előkészítés nem volt megfelelő) Az elektronmikroszkópban készített képek, azaz metszetek összehasonlíthatóságának feltétele, hogy azok szinte egyforma vastagok legyenek, a blokkot előretoló szerkezetnek így megbízhatóan kell működnie. Ez kifejezetten fontos, ha sorozatmetszeteket készítünk, s a minta egyetlen „szeletét” sem veszíthetjük el. Az ultravékony metszetek nagyon érzékenyek, könnyen szakadnak (4.30.B ábra), a rostélyok annyira könnyűek, hogy egy-egy fuvallat, tüsszentés is elröpíti őket. A metszés során nagyon fontos a munkaterület tisztán tartása, a szennyeződési lehetőségek minimalizálása és a nyugodt, huzatmentes környezet.
Az ultramikrotechnikában használt kések üveg- vagy gyémántkések. Az üvegkéseket – megfelelő szabályok szerint – üvegcsíkból,késtörő berendezéssel, saját magunk készítjük (4.31. ábra).
Az üvegcsíkból négyzet alakú darabokat vágunk, majd ezekből egyenként két-két háromszög alakú kést készítünk (4.31. ábra). Ha megfelelően járunk el, akkor a késeknek egy tompa és egy hegyes, éles éle lesz (4.32.A ábra):az utóbbi törésvonala ívelt – ez a megfelelő vágóél (4.33.A ábra). A berendezésben egy gyémánthegy van, amellyel a kívánt helyen bekarcoljuk a rögzített üvegdarab felszínét, majd azt a karcolás mentén eltörjük.
4.31. ábra.Régebbi típusú késtörő berendezés üvegcsíkkal és a kész kések (jobb felső sarok)
Az üvegkésre desztilláltvizet tartó medencét(kádat) ragasztunk fényes ragasztószalagból, amelynek alsó szegélyét folyékony paraffinnal vagy körömlakkal lezárjuk (4.32.B ábra). Az elkészített késeket meghatározott ideig, pormentesítés céljából lezárt dobozban tárolhatjukis, de idővel az élük „elfolyik” (az üveg amorf kristályos szerkezete átrendeződik), s használhatatlanokká válnak.
4.32. ábra.Kések: üvegkés (a jobb láthatóság kedvéért vékony fekete vonallal körülrajzoltuk), előtte előre gyártott, felragasztható víztároló medence (A), üvegkés szalagból ragasztott víztárolóval (B) és gyémántkés (C) Az üvegkések éle sérülékenyebb, mint a készen kapható gyémántkéseké, s ultravékony metszésre csak egy adott szakaszuk alkalmas (4.33. ábra). Sajnos a gyémántkések éle sem örök életű, a használat során ez is sérülhet. A késhibák a metszeten húzott ún.késcsíkformájában azonosíthatók (4.34. ábra).
4.33. ábra.Üveg- (A) és gyémántkés (B) éle nagy nagyításon: az A ábrán jól látszik az íves törésvonal, ami az éles, metszésre alkalmas élt jelzi
4.34. ábra.Sérült késél által húzott csík a metszeten
A metszés menete a következő. A kifaragott blokkot rögzítjük a tárgybefogóba. Kiválasztjuk a megfelelő kést, s azt rögzítjük a késbefogóba. A kés dőlésszöge állítható, s a blokk (a polimerizált beágyazószer) tulajdonságaihoz igazítható (4.27. ábra). A blokkot a blokkbefogó állítócsavarjai segítségével úgy igazítjuk, hogy a trapéz vagy téglalap rövidebb párhuzamos élét a kés felé fordítjuk, majd a kés élével párhuzamosra állítjuk. Ellenőrizzük, hogy a blokk teteje a kés éle előtt mozog-e, s hogy a mozgása közben nem távolodik-e attól (azaz a metszetvastagság azonos lesz a trapéz tetején és alján, 4.35. ábra).
4.35. ábra. A kés és a mögötte lévő kifaragott blokk helyzete a helyes beállítás után: a kés éle párhuzamos a téglalap párhuzamos oldalaival és a blokk felszínére vetett árnyékának vonalával. (A blokk csúcsára faragott piramis éleit a jobb láthatóság kedvéért narancssárga szaggatott vonal jelzi, a kés mögé eső, a felvételen takarásban
lévő éleket vékonyabb vonallal jeleztük.)
Ha az anyagot előzetesen ozmiummal kontrasztosítottuk, akkor helyzete jól látszik a blokkban. A mikrotommal néhány metszetet lehúzunk belőle, így a kifaragott minta egész (kívánt) felszíne bekerül a metszéssíkba.