Jelen fejezet a rácscsatolt interferométer és spektroszkópiai ellipszométer integrálásából megszületett kombinált mérőberendezés szerkezeti vázlatát és elsőmérési eredményeit mutatja be. Az eszköz lényege, hogy a kisebb érzékenységű spektroszkópiai ellipszométer folyadékfázison (folyadékcellán) keresztül, széles hullámhossz-tartományon mérve meghatározza a hordozó felületén épülővékonyréteg opto-geometriai paramétereit, míg a kiemelkedőfelbontással jellemezhetőrácscsatolt interferométer a hordozó felől detektálva feltárja a vizsgált folyamat apró változásait. E két eszköz kombinációja tehát érzékenyebb és információban gazdagabb eredményeket szolgáltat, mint tennék azt külön-külön. A fejezetben ismertetett fehérje adszorpciós kísérlet igazolja, hogy már ez az elsőprototípus is
≈5 pg/ mm2-es felületi és néhány 10 pg/mm2 mélységbeli érzékenységgel képes detektálásra úgy, hogy közben mindkét mérési eljárás előnyei megtarthatók.
Az érzékelők előnyei nem csupán teljesítőképességükkel, árukkal és méretükkel fejezhetők ki.
Rendkívül fontos tulajdonságuk lehet a más eszközökkel való kombinálhatóságuk is, hiszen a jól megválasztott műszerek összeépítésével az egyedi hiányosságok kiküszöbölhetők. A szakirodalom számos olyan hibrid műszerről számol be, melyek esetén valamely eljárás jelét erősíti fel egy másik. Ilyen például a felületi plazmon rezonanciával érzékenyített ellipszometria [16], az interferometrikus fázismodulált ellipszometria [87], illetve a rácscsatolt interferometria is. Meglepőazonban, hogy kevesebbet olvashatunk olyan kombinált készülékekről, amelyek azonos pontban, két eljárással való mérést tesznek lehetővé egy időben. Jól kiválasztott technikák ilyen jellegűösszeházasításának előnye minden esetben az, hogy a két eljárás által függetlenül szolgáltatott mérési adatok egymást kiegészítve részletesebb folyamatanalízist tesznek lehetővé. Tekintsük példának a kvarc kristály mikromérleg és az ellipszometria kombinációját [46, 88], mely lehetővé teszi a felületre leváló anyag tömegének és a létrejött vékonyréteg struktúra opto-geometriai paramétereinek egyidejűés érzékeny mérését.
A dolgozatban bemutatott rácscsatolt interferométer nem tartalmaz mozgó alkatrészeket, így könnyen összeépíthetőmás eszközökkel. A kérdés tehát az, hogy mely mérési eljárásokkal történőa kombinációja lenne előnyös? A spektroszkópiai ellipszométer számos ok miatt hatékony kiegészítője, komplementere lehet a rácscsatolt interferométernek. Mindkettőgyors
roncsolásmentes optikai eljárás, így kombinációjuk szintén alkalmas gyors folyamatok nyomon követésére. A kisebb érzékenységűspektroszkópiai ellipszométer folyadékfázison (folyadékcellán) keresztül, széles hullámhossztartományon mérve meghatározza az összetett vékonyréteg-rendszerek opto-geometriai paramétereit. A kiemelkedő felbontással jellemezhetőrácscsatolt interferométer hordozó felől detektálva feltárja a vizsgált folyamat apró változásait, azonban összetett rétegrendszerek esetén nem képes feltárni azok részleteit.
E két eszköz együttese tehát érzékenyebb és információban gazdagabb eredményeket szolgáltat, mint tennék azt külön-külön. Mivel a rácscsatolt interferométer érzékenysége a felületközeli tartományokra koncentrált, az ellipszometria azonban a teljes fényúton detektál, szellemes kísérletek tervezése esetén elképzelhetőaz is, hogy az eddig elválaszthatatlan folyamatokat alkotóikra bontsunk.
9. 1. A mérési összeállítás
Doktori munkám keretében, egy olyan rácscsatolt interferométer - spektroszkópiai ellipszométer kombinált összeállítást építettem, mely segítségével azonos pontban, két különbözőoptikai jelátalakító eljárással követhetőnyomon egy időben a vizsgálni kívánt folyamat. A kísérleteket az előzőfejezetekhez hasonlóan most is a rácscsatolt interferométer integrált optikai egységére illesztett folyadékcellában végeztem. Az egyetlen különbség, hogy az itt alkalmazott cella két kvarc ablakkal is rendelkezik, hogy az ellipszométer vizsgáló fénynyalábja szintén érhesse az érzékelőfelületet, illetve, hogy innen visszaverődve a detektorba juthasson. (9.1.-1. ábra) Fontos megjegyezni, hogy az ellipszométerek folyadékcellái technikai okokból egyetlen fix, azonban (0° és 75° között) szabadon megválasztható beesési szögre tervezhetők. Ennek értékét a későbbiekben használt oldatok és a hullámvezetőoptikai tulajdonságainak ismeretében úgy optimalizálhatjuk, hogy a lehető legnagyobb érzékenység mellett mérhessünk majd a kísérletek során. Szimulációk alapján a beesési szög értékét 55°-ban határoztuk meg.
E kombinált műszer megtervezésekor két tényezőt kellett szigorúan figyelembe vennem. Az elsőaz, hogy a forgó alkatrészeket tartalmazó ellipszométer fejek (fényforrás, detektor) semmiképp sem lehetnek direkt mechanikai kapcsolatban az optikai asztallal, mert az ezen megépített rácscsatolt interferométer felbontása – azok rezgést keltőhatása miatt –jelentősen csökkenne még referencia alkalmazása esetén is. A második, hogy a beállíthatóság érdekében, az összeállítás minden eleme finoman, egymástól függetlenül pozícionálható kell legyen a fényutaknak megfelelően, még teljesen összeszerelt állapotban is.
9.1.-1. ábra: A rácscsatolt interferométer - spektroszkópiai ellipszométer kombinált műszer jelátalakító egységének sematikus vázlata.
a.) b.)
9.1.-2. ábra: A megvalósított rácscsatolt interferométer - spektroszkópiai ellipszométer kombinált műszer kísérleti elrendezése látható az a.) ábrán. A felső, fehér ellipszissel határolt rész nagyított formában a b.) ábrán tekinthetőmeg.
A fentiek figyelembevételével az ellipszométer fényforrását és detektorát rögzített szögben tartó, horizontális és vertikális irányokban mozgatható vázszerkezetre csavaroztam, majd ezt a gumitömlőkkel rezgésmentesített optikai asztalt tartó alátámasztásra helyeztem. A rácscsatolt interferométer integrált optikai egységét, és rajta az ellipszométer vizsgáló fénynyalábjának megfelelően pozícionált folyadékcellát egy hat szabadsági fokú, finoman szabályható tárgyasztalon rögzítettem. Az optikai asztalon úgy rendeztem el a második generációs rácscsatolt interferométer további elemeit, hogy a szabad terjedésűrészből kilépőpárhuzamos nyalábok becsatoljanak az integrált optikai egységbe. A méréseket két külön számítógép, az előzőfejezetekben ismertetett programokkal vezérelte. A megvalósított összeállítás a 9.1.-2.
ábrán látható.
9. 2. Az elsőmérési eredmény
A kombinált rendszer működőképességének igazolására egy egyszerűfehérje adszorpciós kísérletet terveztem. Célom az volt, hogy a két eszköz által szolgáltatott jel összehasonlításából következtethessek arra, hogy az összeállítás valóban ígéretes-e a tervezett, összetettebb kísérletek vizsgálatára. Ahhoz, hogy ez az adszorpciós folyamat jól mérhetőlegyen mindkét eljárással, a következőket kellett figyelembe vennem: Egyrészről, a leválasztott fehérjeréteg vastagsága nem érheti el az evaneszcens mezőáltal pásztázott réteg karakterisztikus vastagságát. Ez biztosítja a rácscsatolt interferométer érzékenységét a fehérje-vékonyréteg térfogatában. Másrészről, az ellipszométer nagyságrendekkel kisebb felbontását figyelembe véve – hogy vastagabb monoréteget kapjunk – a teszt fehérje molekulatömege relatíve nagy kell, hogy legyen. Megjegyzendő, hogy ezek a megkötések még tág határokat biztosítanak a választásra. Előkísérletek alapján a szakirodalomban jól ismert, 340 kDa molekulatömegű, 45 nm x 9 nm x 6 nm-es bennfoglaló méretűfibrinogén fehérjét választottam [89, 90].
A folyadékcellát 0,5 ml/perces áramlási sebesség mellett folyamatosan addig öblítettem PBS oldattal, míg stabil alapvonalat nem mértem a rácscsatolt interferométerrel is. Ezt követően 0,1 mg/ml koncentrációjú fibrinogén oldatot áramoltattam a cellába. A fehérje felületi adszorpciójának lassú szakaszát megszakítva újra PBS oldattal öblítettem át a cellát.
A rácscsatolt interferométer által mért relatív fáziskülönbség értékeket a „8. Rácscsatolt interferométer bioszenzorikai kísérletekhez” című fejezetben leírtaknak megfelelően határoztam meg. A spektroszkópiai ellipszométerrel mért spektrumokból (a „6. 2. In situ felületanalízis” címűalfejezetben felvázolt kiértékelési ismeretek alapján) kapott vastagság és törésmutató értékekre a de Feijter formulát alkalmazva, számoltam ki az adszorbeálódó
9.2.-1. ábra: A kombinált kísérleti összeállítással mért fibrinogén fehérje felületi adszorpciójának időfejlődése. Az a.) ábrán a rácscsatolt interferométerrel, a b.) ábrán a spektroszkópiai ellipszométerrel kapott kísérleti eredmények láthatók. A c.) ábra a két mérés egymáshoz illesztett görbéi láthatók.
fehérje felületi tömegsűrűségét. A kombinált műszerrel kapott, 6 másodperces időablakokra átlagolt kísérleti eredményeket a 9.2.-1.a. és 9.2.-1.b. ábra szemlélteti. A 9.2.-1.c. ábrán látható, hogy a két független mérésből származó görbe hibahatáron belül egymáshoz illeszthető. Ez pedig bizonyítja, hogy a műszer kombináció valóban alkalmas folyadékcellabeli kísérletek egyidejűvizsgálatára.
Megjegyzendő, hogy a spektroszkópiai ellipszométer érzékenysége a széles hullámhossztartományban rögzített spektrumbeli apró változások integrálásából származik.
Ennek okán nem képezhette az összehasonlítás alapját egyik, tetszőlegesen kiválasztott hullámhosszon mért ellipszometriai mennyiség sem. Mivel a rácscsatolt interferométer tulajdonképpen az érzékelő felületen végbemenőanyagmennyiség változást méri, a legmegfelelőbb eljárás, ha az ellipszometriai spektrumok kiértékeléséből számított felületi tömegsűrűséget hasonlítjuk össze a relatív fáziskülönbség értékekkel.
A rácscsatolt interferométerrel mért görbe alapvonalának átlag körüli szórásából meghatározhatjuk a mérés érzékenységét. Ezt összehasonlítva azzal az értékkel, mely az önálló berendezésre érvényes, becsülhetjük, hogy a rácscsatolt interferométer felbontása még a kombinált állapotban is hozzávetőlegesen 5 pg/mm2. Ennek alapján kijelenthető, hogy a műszeregyüttessel a spektroszkópiai ellipszométer felületi vékonyrétegekben végbemenő változásokra való érzékenységét körülbelül egy nagyságrenddel sikerült javítanom.
9. 3. Összegzés és kitekintés
A fentiekben nem csupán azt igazoltam, hogy a két eszköz összeépíthetőés ≈5 pg/ mm2-es felületi és néhány 10 pg/mm2 mélységbeli érzékenység mellett alkalmazható egyidejűleg folyadékcellabeli folyamatok nyomon követésére, hanem azt is, hogy az összeépítés előnyös mindkét műszer számára. Arra azonban nem adtam magyarázatot, hogy a kombináció pillanatnyilag miért jár a rácscsatolt interferométer érzékenységének csökkenésével. Ennek oka, hogy az ellipszométer forrás és detektor fejeiben található forgó alkatrészek durva zajhatásától nem szigetelhetőmegfelelően a rácscsatolt interferométer. Megjegyzendő, hogy a rácscsatolt interferométer rendkívüli stabilitása abban is megmutatkozik, hogy e folyamatos rezgés nem tette lehetetlenné a vele való mérést, sőt csupán kis hatással volt az érzékenységére. A jövőben az összeépítés teljesítőképességét olyan (kereskedelemben már kapható, fotoelasztikus modulátort tartalmazó) ellipszométer fejek alkalmazásával kívánjuk javítani [91], melyek – a rácscsatolt interferométerhez hasonlóan – nem tartalmaznak mozgó alkatrészeket. A két statikus rendszer kombinációjával várhatóan tovább javítható a műszeregyüttes érzékenysége.
A közeli jövőben olyan kísérleteket kívánunk majd végrehajtani, melyek során intenzíven kihasználhatók a spektroszkópiai ellipszométer és a rácscsatolt interferométer egymást kiegészítőtulajdonságai: A rácscsatolt interferométer érzékenysége a felületközeli régiókra koncentrált, a spektroszkópiai ellipszométeré azonban alkalmas a felülettől távolabbi, a
rácscsatolt interferométer evaneszcens mezején kívül esőrétegek részletes vizsgálatára is. Így a kombinált összeállítással kísérletileg tovább vizsgáljuk az érzékelőfelülethez rögzített, hosszú flagelláris filamentumok oldatbeli struktúráját. Az ellipszométer a mért spektrumok révén részletes információt ad a hordozó felületét borító vékonyréteg rendszerről. Így önszerveződővékonyrétegek rétegről-rétegre való leválasztásával (a relatív fáziskülönbség értékekből és az ellipszometriai spektrumokból kiértékelt vastagság adatokból) akár kísérletileg is kimérhetnénk az evaneszcens mezőkarakterisztikus paramétereit.
Az alkalmazási lehetőségek sorának csupán a képzelet szabhat határt. Bízunk abban, hogy ez az újonnan bevezetett kombinált mérési eljárás olyan kísérleti eredményekre mutathat, melyek mindezidáig rejtve maradtak a kutatók előtt.
10. Összefoglalás
A nanotechnológia területén az évtized egyik főkutatási iránya olyan érzékelők, érzékelő -rendszerek megalkotása és fejlesztése, melyek képesek mind nagyobb és nagyobb érzékenységgel, gyors és költséghatékony módon detektálni akár kisebb molekulák, sőt akár önálló atomok valamilyen felismerőelemhez történőkötődését is.
A Pannon Egyetem Nanotechnológia Tanszékén kifejlesztés alatt álló flagelláris filamentumok ígéretes eszközei a jövőúj eredményekre mutató bioszenzorikai kísérleteinek.
Ezek a bakteriális eredetűfehérjeszálak várhatóan parányi molekulák, illetve akár atomok nagy affinitású, specifikus megkötését teszik majd lehetővé tervezhetőmódon. Ahhoz azonban, hogy a kötési eseményeket mérhetőjellé formáljuk, számos feladatot kell megoldanunk.
A megbízható, hiteles érzékelés egyik kulcsa, hogy a flagelláris filamentumokat reprodukálható és pontosan kézben tartott módon válasszuk le az érzékelőfelületre. Doktori munkámban megmutattam, hogy a spektroszkópiai ellipszometria, mint roncsolásmentes és költséghatékony optikai eljárás, alkalmas összetett szerkezetű, sőt akár átlátszó hordozókra leválasztott flagelláris filamentum rétegek opto-geometriai paramétereinek meghatározására.
Folyadékcella alkalmazásával e módszer kiválóan használható e fehérjék felületre való leválasztásának in situ és valós idejűnyomon követésére, sőt akár minősítésére is. A spektroszkópiai ellipszométerrel mért spektrumokból, összetett optikai modellekkel a fehérjeréteg tömegsűrűségének mélységbeli változása megadható, mely alapján a filamentumok háromdimenziós felületi struktúrája tovább kutatható.
A bioérzékelés másik fontos momentuma, a nagy érzékenységűjelátalakító eszköz, mellyel a felismerőelem - célmolekula megkötési események valós időben és in situ nyomon követhetők. Doktori munkám második részében, egy ún. rácscsatolt interferométer jelátalakító prototípus megépítéséről és fejlesztéséről számoltam be. Biológiai kísérletekkel bebizonyítottam, hogy ez az egyszerűés olcsó optikai elemeket tartalmazó eszköz akár hozzávetőlegesen 0,5 pg/mm2-es, illetve néhány 10 Da-os érzékenység mellett képes a detektálásra. Összehasonlítva napjaink legnépszerűbb és legelterjedtebb jelátalakítóival kijelenthető, hogy e műszer kiváló teljesítőképességével azok nagy többségét felülmúlja.
Végezetül megmutattam, hogy a mozgó alkatrészt nem tartalmazó rácscsatolt interferométer nem csupán összeépíthetőa spektroszkópiai ellipszométerrel, hanem e műszeregyüttes alkalmas azonos pontban való párhuzamos mérésekre is.