Dr. Secenji Aleksandar
1,2, Horváth Barbara
11PTE TTK Kémiai Intézet, Általános és Fizikai Kémia Tanszék, Ifjúság útja 6., H-7624 Pécs, Magyarország
2Pécsi Tudományegyetem, Szentágothai János Kutatóközpont, Ifjúság útja 20., H-7624 Pécs, Magyarország
Az optikai szenzorok iránti érdeklődés az utóbbi két évtizedben jelentősen megnőtt, ami az optoelektronikai eszközök fejlődésére vezethető vissza. Az optikai pH mérés kiemelkedő szerepet játszik az optikai érzékelés körében, mivel pH mérésre nem csupán a mindennapos laboratóriumi munka során van szükség, hanem a kémia és biotechnológia, valamint az orvostudomány minden területén.
Az élő sejtek vizsgálata kulcsfontosságú, hiszen a sejtek minden élő szervezet építőkövei, folyamatosan változó, dinamikus rendszerek. Működésüket csak akkor érthetjük meg igazán, ha élő sejten belüli, valós idejű méréseket tudunk végezni.
A sejtek méretüknél fogva fénymikroszkóppal egyszerűen vizsgálhatók. A fluoreszcencia mikroszkópia jól bevált kutatási eszköz, ahol a szöveteket fluoreszcens indikátor oldattal festik meg. Nagyszámú molekuláris érzékelőt fejlesztettek ki ehhez a mérési módszerhez, amelyeknek azonban hátránya, hogy a sejt komponenseivel nemkívánatos reakcióba léphetnek, így azok működése megváltozhat. Emiatt legtöbbször csak a vizsgálni kívánt paraméter koncentráció viszonyainak meghatározását tudják elvégezni. Ha a molekuláris érzékelőket nanorészecskékbe zárjuk, akkor ezek a hátrányok kiküszöbölhetők1, mivel a fluoreszcens indikátorok nem kerülnek közvetlen kapcsolatba a sejtet alkotó elemekkel. Ha a nanorészecskék anyagi minőségét megfelelően választjuk meg, akkor a rendszer csak a vizsgálni kívánt komponens számára lesz átjárható.
Felületmódosítással elérhetjük, hogy a nanoszenzor a sejtmembrán természetes cserenyílásain keresztül bejusson a sejtekbe, és ne zavarja azok normális működését.
Nanorészecskéknek nevezzük az 1-500 nm mérettartományba eső szerves-, szervetlen- és kompozit anyagokat. Kis átmérőjüknek köszönhetően olyan rendszerekben is alkalmasak lehetnek optikai szenzor alapanyagként, ahol más érzékelő használata a mérete miatt korlátozott, például sejtekben vagy mikroorganizmusokban. Nagy felületük miatt rövid válaszidejűek. Az ún. PEBBLE szenzorok (Probes Encapsulated by Biologically Localized Embedding) olyan nanorészecskék, amelyeket biológia mintákban, sejten belüli mérésre alkalmaznak, és tartalmazzák az optikai méréshez szükséges komponenseket2.
Wolfbeis és munkatársai oldott oxigén koncentrációt mértek sejtekben, ahol optikai nanoszenzort használtak3. Olyan modern technológiát alkalmaztak, amivel hagyományos mikroszkóppal és digitális fényképezőgéppel is tudtak az oldott oxigén koncentrációról eloszlási képet készíteni. A sejten belüli pH eloszlás meghatározásáról fluoreszcens képalkotással, olyan publikáció jelent meg, ahol a költséges, konfokális pásztázó mikroszkópiás eljárást használták képalkotásra4.
A digitális fényképezőgépek egyszerűbb képalkotást tesznek lehetővé, mint a pásztázó mikroszkópiás eljárások. Bennük CCD érzékelő lapka található, amely
képpontonként rögzíti az információkat. A kép színét és intenzitását pixelenként három különböző hullámhossz tartomány rögzíti (RGB kamera: piros, zöld és kék). A szenzor technikában a digitális fényképezésnek úgy használhatják ki ezt a képalkotási módját, hogy olyan érzékelőt készítnek, amelynek az optikai jele a három hullámhossz tartomány valamelyikébe esik. Emiatt számos kombinációja lehetséges az optikai szenzorok készítésének. A rögzített jelből a megfelelő módon kémiai-analitikai információhoz juthatunk, melynek feldolgozásához számos szoftver rendelkezésére áll a kutatóknak, ilyen például az ImageJ program5.
A biológiai rendszerekben fluorimetriás méréseken alapuló optikai szenzorokat alkalmaznak. A legegyszerűbb méréstechnika a fluoreszcencia intenzitásának mérése, ami azonban a zavaró hatásokra érzékeny, mint például a fényforrás intenzitásának fluktuációja, vagy a hőmérséklet. Ennek kiküszöbölésére több technikát is kidolgoztak, az egyik a kettős gerjesztési- vagy emissziós hullámhosszon mért fluoreszencia intenzitás arányának képzése6.
Korábbi munkánk során Stöber- és módosított Stöber-szilika nanorészecskék szintézisével foglalkoztunk. Megvizsgáltuk, hogy a szilika nanorészecskék mérete hogyan befolyásolható a reakciókörülmények helyes megválasztásával, és hogyan változtatható a felületi tulajdonsága különböző módosított szilánok használatával. Emiatt, és a nanorészecskék fent ismertetett előnyös tulajdonságai miatt, az optikai szenzor építőelemeként Stöber-szilikát választottam. A hagyományos Stöber-szintézis és Philbert munkássága nyomán7 olyan mag-héj szerkezetű, módosított Stöber-szilika nanorészecskéket szintetizáltam, amelyek méretüknél fogva alkalmasak lehetnek sejten belüli vizsgálatok elvégzésére.
A szenzor tervezéséhez a következő fluorimetriás méréstechnikát választottuk: a gerjesztés egy hullámhosszon történik, és két fluoreszcens indikátor van a rendszerben, amelyeknek eltérő emissziós hullámhossza van, így a fluoreszcencia intenzitásának aránya szolgáltatja az információt. A legtöbb zavaró hatás egyforma mértékben befolyásolja a két jelet, arányuk csak a pH változásától függ. A rendszerben mind a két indikátor fluoreszcencia intenzitása függ a pH-tól, de a változásuk ellentétes előjelű. A két indikátort ennek megfelelően választottam ki.
A nanorészecskék magjába pH érzékeny porfirinvázas indikátort zárványoztam, héjához pedig pH érzékeny naftalamid származékot immobilizáltam. Utóbbit Niu és kollégáinak munkája alapján állítottam elő8, mely PET mechanizmus (photo-induced electron transfer mechanism)9 szerint érzékeli a pH változást. A nanorészecskék felületmódosításával olyan stabil nanoszenzor szuszpenziót készítettem, amelynek a felületi tulajdonságai lehetővé teszik a sejtfalon keresztül történő átjutást.
A kész fluoreszcens optikai nanoszenzor mérete, felületi- és spektrális tulajdonságai miatt alkalmas sejten belüli pH eloszlási kép felvételére digitális fényképezőgépek segítségével.
1. ábra: pH érzékeny optikai nanoszenzor előállítása
(OEP: oktaetil-porfirin, AiPN: N-allil-4-izopropil-piperazinil-1,8-naftalamid, TEOS:
tetra-etoxi-szilán, VTES: vinil-trietoxi-szilán, ABUTES: amino-butil-urea-trietoxi-szilán)
2. ábra: Nanoszenzor fluoreszcencia intenzitása a pH függvényében (λmax [AiPN]=527 nm, λmax [OEP]=620 nm), Michaelis-féle foszfát pufferben vizsgálva
[1] John X. J. Zhang, Kazunori Hoshino: Optical Molecular Sensors and Optical Spectroscopy; Molecular Sensors and Nanodevices 2014
[2] Yong-Eun Koo Lee and Raoul Kopelm: Nanoparticle PEBBLE Sensors in Live Cells;
Methods in Enzymology, Volume 504
[3] Xu-dong Wang, Hans H. Gorris, Judith A. Stolwijk, Robert J. Meier, Dominik B. M.
Groegel, Joachim Wegener and Otto S. Wolfbeis: Self-referenced RGB colour imaging of intracellular oxygen; Chem. Sci., 2011, 2, 901
[4] Tanja Bagar, Kirsten Altenbach, Nick D. Read and Mojca Bencina: Live-Cell Imaging and Measurement of Intracellular pH in Filamentous Fungi Using a Genetically Encoded Ratiometric Probe; American Society for Microbiology May 2009, p. 703–
712
[5] http://dx.doi.org/10.1533/9780857090195.1.147
[6] I. Sanchez-Barragan, J.M. Costa-Fernandez, A. Sanz-Medel, Marta Valledor, Francisco J. Ferrero, Juan Carlos Campo: A ratiometric approach for pH optosensing with a single fluorophore indicator; Analytica Chimica Acta 562 (2006) 197–203 [7] a,W. Stöber, A. Fink, E. Bohn: Controlled Growth of Monodispersed Silica Spheres in
the Micron Size Range; Journal of Colloid and Interface Science 26 (1968), 62-69 b, Yong-Eun Lee Koo, Youfu Cao, Raoul Kopelman, Sang Man Koo, Murphy Brasuel and Martin A. Philbert: Real-Time Measurements of Dissolved Oxygen Inside Live Cells by Organically Modified Silicate Fluorescent Nanosensors: Anal. Chem. 2004, 76, 2498-2505
[8] Proton off-on behaviour of methylpiperazinyl derivate of naphthalimide: a pH sensor based on fluorescence enhancement;Cheng-Gang Niu, Guang-Ming Zeng, Li-Xin Chen, Guo-Li Shen, Ru-Qin Yu; Analyst 129 (2004) 20-24
[9] Paola Ceroni, Vincenzo Balzani, Alberto Credi:Molecular Devices and Machines_Chapter 2: Photoinduced Energy and Electron Transfer Processes; John Wiley and Sons 2006