1 Szegedi Tudományegyetem, Fizikai Kémiai és Anyagtudományi Tanszék, 6720, Szeged, Aradi vértanúk tere 1.
Bevezetés
A hidrogélek mechanikai, kémiai és biokompatibilitási tulajdonságai egyaránt hangolhatóak, így a tudományos érdeklődés tárgyát képezik. Ezeknek az anyagoknak számos felhasználása lehetséges, például a mesterséges szövetek tervezésében, a gyógyászati hatóanyagok szállításában és szabályozott leadásában. Amennyiben a hidrogéleket mágneses részecskékkel (magnetit, maghemit, kobalt-ferrit) töltjük meg, mágneses hidrogélek állíthatók elő. Ezzel a módosítással a mágneses hidrogélek sokkal alkalmasabbak lehetnek egyes orvosbiológiai felhasználások esetében, például a hatóanyagok célzott szállításában, illetve a rák kezelése során a szabályozott gyógyszereladás és mágneses hipertermiás kezelés kombinálásához.[1,2]
A mágneses hirdogélek előállításának három, alapvetően eltérő módja ismert: a bekeveréses, az in situ kicsapásos és a beoltásos módszerek.[1] Számos mágneses hidrogél előállítása ismert, például a szuperparamágneses magnetit nanorészecskék eloszlatása karragén gélben, magnetit nanorészecskék in situ képződése kitozán gélben, illetve rákos megbetegedés kezelésére tervezett kitozán hidrogél előállítása magnetit és béta-glicerofoszfát tartalommal.[2] Az általunk hozzáférhető szakirodalomban azonban nem találtunk mágneses hialuronát-gél előállításáról szóló publikációt. A hialuronát (HyA) makromolekulák adszorpciója miatt a mágneses nanorészecskék flokkulációja következik be, ami csak a magnetit részecskék felületének előzetes módosításával akadályozható meg.[2,3]
Az ízületi porckopás (artrózis) az ízületi problémák egyik leggyakoribb formája. A betegség kialakulásának számos oka lehet, az öröklött tényezők és a fokozott terhelés (nehéz munka, sport, túlsúly) mellett az ízületi folyadék viszkoelasztikusságának csökkenése is hozzájárul, aminek egyik oka az intra-artikuláris folyadék hialuronát tartalmának csökkenése. Az artrózis az ízületek végeit borító porcok károsodása (1.a ábra).
Hosszú, éveken át tartó folyamat során a porc elvékonyodik, sima felszíne berepedezik, majd a teljes porcállomány összetöredezik, és végül lassan felszívódik. Amikor a porc eltűnik, az ízületi végek csontjai közvetlenül érintkezhetnek egymással, aminek következtében a csontfelszínek összedörzsölődnek, ez pedig fájdalommal és csontkárosodással jár.[4]
Ahogyan az évek során az ízületet borító porc folyamatosan kopik, krónikus fájdalom alakul ki, melyhez gyakran az ízület duzzadása is társul. A betegség előrehaladottságának mértékétől függően a rendelkezésre álló terápiás eszközökkel a fájdalom részben csökkenthető, valamint az aktív élet folytatható. A terápiás lehetőségek között szerepelnek a szájon át szedhető szerek, a gyógytorna, az ízületi folyadék pótlása, valamint súlyos esetekben a műtéti beavatkozás. Az ízületi folyadék injekcióval történő pótlása egy régóta alkalmazott kezelési eljárás. Ezeknek az injekcióknak az artózisos ízületbe történő beadása (1.b ábra) következményeként az ízületi folyadék viszkoelaszticitása helyreáll, valamint beindulhat az ízületi porc részleges regenerálódása
része elszivárog a környező szövetekbe, illetve a szervezet természetes lebontó folyamatainak eredményeként a hialuronát egy adott idő után elbomlik. Ez az idő megnövelhető például térhálósított hialuronát-gélek alkalmazásával. Az ízületekbe, különös tekintettel például a térdízületbe befecskendezett gélek a terhelés során a klasszikus fizikai törvényeknek engedelmeskedve kiszorulnak az ízületek szélére. Így a mozgás során pont azon a helyen csökken nagyobb mértékben a gél mennyisége, ahol a megkopott porcokat kellene egymástól távol tartani a fájdalom és a további mechanikai károsodás elkerülése érdekében. A kiszorulási folyamat csökkentésére mágneses hialuronát-gélt igyekszünk tervezni, így a gél az ízületben azon a helyen maradna, ahol arra a legnagyobb szükség van, tartva a megfelelő távolságot a fájó részek között, ugyankor biztosítva a szükséges kenést a mozgás során.[4]
A kutatásunk célja olyan hialuronát alapú mágneses hidrogél előállítása és szisztematikus jellemzése, ami a későbbiekben alkalmas lehet ízületi folyadék pótlására is.
1. ábra (a) Egészséges és porckopásos ízület sematikus rajza[5] (b) Ízületi folyadék pótlása intra-artikuláris injekcióval.[6]
a) b)
Kísérleti anyagok és módszerek
Ko-precipitációs szintézissel állítottunk elő magnetit nanorészecskéket, FeCl2 és FeCl3 tömény oldatából NaOH-dal történő kicsapással, szobahőmérsékleten levegő jelenlétében. Az előállított magnetit nanorészecskéket röntgendiffrakcióval azonosítottuk (Bruker D8 Advance), a részecskeméretet pedig transzmissziós elektronmikroszkóppal (TEM) készített felvételek segítségével határoztuk meg (Philips CM-10).
A kondorotin-szulfát-A (CSA) (Sigma-Aldrich) és a hialuronát (HyA) (Gyógyszertechnológiai Intézet, SZTE) nátrium só formájában állt a rendelkezésünkre. A poliszacharidok dimer egységei a 2. ábrán láthatóak, a CSA egy ismétlődő egysége egy – COOH és egy –SO3H csoportot tartalmaz, a HyA esetében pedig egy –COOH csoport található egységenként. A fiziológiás körülményekhez közeli pH~6 esetében ezek a funkciós csoportok teljesen deprotonáltak (–SO3–, –COO–), így mind a CSA, mind a HyA polianionos karakterű. A CSA és a HyA mennyiségét ismétlődő egységeikre, azaz a karboxil(át)csoportok anyagmennyiségére vonatkoztatva mmol-ban adjuk meg.
2. ábra (a) A CSA és (b) a HyA ismétlődő egységeinek szerkezeti képlete. [2]
a)
–O3SO
–O3SO
b)
A magnetit nanorészecskék felületét CSA-val módosítottuk, és a részecskéket CSA@MNP-vel jelöljük. A törzs CSA@MNP mintákban a pH~6, a NaCl tartalom 10 mM, a magnetit tartalom pedig 10 g/L. A választott CSA fedések pedig biztosítják a magnetit nanorészecskék stabilitását ezen körülmények között.[2,3] Az előzetesen elkészített MNP illetve CSA@MNP szolokat híg hialuronátos oldatokba, illetve tömény HyA-gélekbe adagoltuk.
Híg HyA-rendszerekben a nanorészecskék részecskeméretét dinamikus fényszórás méréssel (DLS), felületi töltésállapotát pedig zéta-potenciál méréssel vizsgáltuk (Zetasizer NanoZS, Malvern, England) különböző HyA-koncentráció mellett, pH~6 és 10 mM NaCl mellett 25 °C-on.
A hidrogél folyási tulajdonságait szisztematikus reológiai vizsgálatokkal jellemeztük. A méréseket 25 °C-on végeztük el, Physica MCR101 reométerrel (Anton Paar, Austria) lap-lap mérőfejet (d=5 cm) használva. A folyásgörbéket növekvő, majd csökkenő sebességgradiens mellett vettük fel. A „vissza” ág plasztikus folyási tartományát a Bingham modell alapján értékeltük ki: τ = τB + ηpl • dγ/dt, ahol τ a nyírófeszültség, τB a Bingham-féle folyáshatár, ηpl a plasztikus viszkozitás és dγ/dt a sebességgradiens. A viszkoelasztikus tulajdonságokat statikus mérési körülmények között kúszásteszttel jellemeztük. Dinamikus mérési körülmények között pedig az úgynevezett oszcillációs méréseket alkalmaztuk a viszkoelasztikusság jellemzésére, állandó frekvencia illetve állandó nyírófesztültség mellett.[2]
Eredmények bemutatása
A ko-precipitációs eljárással előállított magnetit nanorészecskék röntgendiffraktogramján (3.a. ábra) a csúcsok kicsi intenzitásúak, a Scherrer-egyenlet segítségével meghatározott részecskeméret és a TEM képekből (3.b. ábra) nyert értékek alapján a nanorészecskék ~10 nm-esek és kerekded alakúak. Az ilyen méretű magnetit nanorészecskék szuperparamágnesesek.
3. ábra A magnetit nanorészecskék (a) röntgendiffraktogramja és (b) TEM-képe.
a) 0
20 40 2Q (°) 60 80
a.u.
~ 12 nm
b)
A kutatásaink során először hialuronátra nézve híg rendszerekben végeztünk vizsgálatokat. Az MNP és CSA@MNP részecskék töltésállapotát és átlagos hidrodinamikai méretét (Zave) zétapotenciál és DLS mérésekkel vizsgáltuk a hialuronát (HyA) növekvő mennyiségének függvényében pH~6 és 10 mM NaCl sókoncentráció mellett. Az egyes válogatott mintákról (csupasz MNP és CSA-val fedett MNP) egy nap ülepedési idő után készült fényképeket és a sorozatokra mért kísérleti eredményeket a 4. ábrán mutatom be.
4. ábra Az MNP és CSA@MNP részecskék (a) stabilitása és (b) részecskemérete különböző mennyiségű HyA jelenlétében (pH~6, 10 mM NaCl).
MNP
0 500 1000 1500 2000 2500
0 0.5 1 1.5 2 2.5
HyA (mmol/g)
Zave (nm)
MNP
CSA@MNP 0.2 mmol/g CSA@MNP 1.0 mmol/g CSA@MNP 0.4 mmol/g
STABIL AGGREGÁLT
CSA@MNP
HyA: növekvő mennyiség
HyA: növekvő mennyiség
a) b)
MNP
0 500 1000 1500 2000 2500
0 0.5 1 1.5 2 2.5
HyA (mmol/g)
Zave (nm)
MNP
CSA@MNP 0.2 mmol/g CSA@MNP 1.0 mmol/g CSA@MNP 0.4 mmol/g
STABIL AGGREGÁLT
CSA@MNP
HyA: növekvő mennyiség
HyA: növekvő mennyiség
a) b)
A fényképeken látható, hogy a csupasz MNP csak bizonyos koncentráció tartományban alkot stabil rendszert a HyA-tal, míg a CSA-val felületmódosított MNP mindvégig stabil, nem ülepedő rendszert alkot. Az átlagos hidrodinamikai méret (Zave) vizsgálatakor megfigyelhető, hogy a csupasz magnetit kis hialuronát-koncentráció mellett aggregálódik, aminek oka az, hogy a magnetit felületén a HyA adszorpciója miatt eltérő töltésállapotú, ellentétes töltéselőjelű helyek jönnek létre. Nagy HyA-koncentrációnál szintén aggregálódik a rendszer, mivel ekkor feltételezhetően a makromolekula flokkuláló hatása dominál. A köztes HyA-koncentráció tartományban stabil rendszereket kaptunk. Az első mintasor jól szemlélteti a csupasz MNP viselkedését a növekvő HyA mennyiséggel szemben. Mivel a célunk az, hogy tömény hialuronát-gél rendszerbe adagoljuk a magnetitet, így a csupasz MNP erre a célra nem alkalmas.
A CSA@MNP mintánál a hozzáadott CSA mennyiségét a korábbi tapasztalatok alapján úgy választottuk ki, hogy az stabil mágneses folyadékot alkosson. A CSA-val előre felületmódosított MNP a vizsgált HyA-koncentráció tartományban végig stabilnak mutatkozott. A minták pár napos állás után sem ülepedtek (második mintasor).
A hialuronát feloldásával elkészített hidrogélbe borítatlan MNP illetve felületmódosított CSA@MNP részecskéket kevertünk. Az elkészített géleket az 5. ábrán láthatjuk. A borítatlan magnetit nanorészecskék az előzetes elvárásainknak megfelelően valóban nem oszlathatóak el egyenletesen nátrium-hialuronát-gélben. Ugyanakkor a kondroitin-szulfát-A-val felületmódosított részecskék felhasználásával mágneses hidrogél állítható elő pH~6 esetén. A vizuális megfigyelések alapján az előállított géleket hűtőszekrényben tárolva az MNP részecskék térbeli eloszlása ~3 hónap után is egyenletes.
A vizsgált MNP-koncentráció tartományban a géleket jellemző reológiai paraméterek (például a folyásgörbék "vissza" ágából meghatározható Bingham-féle folyáshatár és plasztikus viszkozitás (5.ábra)) a mérések hibahatárán belül függetlenek az MNP mennyiségétől.
A kúszásteszt és oszcillációs vizsgálatok eredményei alapján az előállított mágneses hidrogél megőrzi a HyA-gélre jellemző viszkoelasztikus tulajdonságot, azaz a paraméterektől függően a gél domináns viselkedése egyaránt lehet viszkózus illetve elasztikus is. Ez alapvető funkcionális tulajdonsága az ízületi folyadéknak, ugyanis az ízületekben terhelésmentes környezetben (állás) biztosítja a vázrendszer „tartását”
(viszkózus tulajdonság), ugyanakkor nyíró erőnek kitéve (mozgás) biztosítja a szükséges
„kenést” (elasztikus tulajdonság) a porcok között.
5. ábra (a) HyA-gél, MNP illetve CSA@MNP részecskékkel bekeverve, (b) stabil hidrogélek folyásgörbéje (Bingham modell alapján kiértékelve).
a)
0 500 1000 1500 2000
0 0.5 1 1.5 2 2.5
HyA (mmol/g)
Zave (nm)
MNP
CSA@MNP (1.0mmol/g) CSA@MNP (0.4mmol/g)
HyA-gel +MNP
+CSA@MNP
b)
0 10 20 30 40 50
0 10 20 30 40 50
sebességgradiens (s-1)
nyírófeszültség (Pa)
0 g/L 0.2 g/L HyA-gél
HyA-gél +CSA@MNP
0 10 20 30 40 50
0 10 20 30 40 50
sebességgradiens (s-1)
nyírófeszültség (Pa)
0 g/L 0.2 g/L HyA-gél
HyA-gél +CSA@MNP
Összegzés
Sikeresen előállítottunk hialuronát alapú mágneses hidrogélt. A rendelkezésünkre álló mérési eredmények alapján elképzelhető az ízületi folyadék pótlásaként történő alkalmazás, de még további kísérletek szükségesek a fiziológiás körülmények pontosabb megközelítésével, a magnetit tartalom növelésével, illetve magnetoreológiás mérések elvégzésével.
A kutatás az OTKA (NK 84014) és a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 Nemzeti Kiválóság Program című kiemelt projekt keretében zajlott. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósul meg.
Irodalomjegyzék
[1] Y. Li, G. Huang, X. Zhang, B. Li, Y. Chen, T. Lu, T. J. Lu, F. Xu; Advanced Functional Materials, 2013 (23) 660–672.
[2] I. Y. Tóth, G. Veress, M. Szekeres, E. Illés, E. Tombácz; Journal of Magnetism and Magnetic Materials (benyújtva)
[3] I. Y. Tóth, E. Illés, M. Szekeres, E. Tombácz; Journal of Magnetism and Magnetic Materials (közlésre elfogadva)
[4] http://hidrogel-ti.blogspot.hu/2014_04_01_archive.html (2014.10.12.) [5] http://www.easyinsole.com/hu/labbetegsegek/fajdalmas-izuleti-kopas/71/
(2014.10.12.)
[6] http://www.osteoarthritisblog.com/wp-content/uploads/2010/07/hyaluronate.jpg (2014.10.12.)