Molekuláris vizsgálatok

III.6.1.Notch inhibitor rezisztens HL sejtvonalak onkogén mutációinak, illetve más sejtek IDH mutációjának vizsgálata

A mutációs vizsgálatok esetében 3 x 10⁶ sejtből DNS Mini Kittel izolált DNS-t használtunk.

Az FBXW7 5, 9, 10 és 11-s exonjait vizsgáltuk – ezekben van leggyakrabban mutáció, ezeket amplifikáltuk a megfelelő primerek segítségével (FBXW7 5: sense 5'-TGTGAGTTTTCCTTTATAAGCCTGT antisense 5'-CAAATAACACCCAATGAAGAATG FBXW7 6: sense 5'-TCAGAGTGCAGAATTATATTTATCAAG antisense

5'-TTTCAGAATCACTCTGCTTTTCA FBXW7 9: sense

5'-TTTAAATCACTTTTCCTTTCTACCC antisense 5'-AGGGCCCAAATTCACCAATA

FBXW7 10: sense 5'-TTGAAAATGGTTGTTGCTGTG antisense

5'-TGGATCAGCAATTTGACAGTG FBXW7 11: sense 5'-TCCTCTTCCCCCTTTCCTAC antisense 5'-GAGGTTGACTCTTTTTGTGATGC.). Amplifikálás (Ready Mix, Thermo Scientific) után BigDye Sequencing Kittel (Applied Biosystems) szekvenáltunk, majd NucleoSEQ (Macherey-Nagel) oszlopot használtunk a kapilláris gélelektroforézist megelőzően (Genetic Analyzer 3500 – Applied Biosystems) A PIK3CA 9-es és 20-as exonját piroszekvenálással Katsuhiko Nosho és munkatársai protokolja alapján végeztük el (298). A HL sejtvonalak esetében 50 onkogén mutációs forrópont vizsgálatát új generációs szekvenálással az Oncompass Medicine – Molekuláris diagnosztika segítségével elemeztük (a hg 19 humán referencia genomhoz hasonlítva; Ion AmpliSeq™ Cancer Hotspot Panel v2, Life Technologies). Az IDH1 és IDH2 gén vizsgálatához AmpliTaqGold Master Mix amplifikáció

(IDH1 4. forward: AAAACTTTGCTTCTAATTTTTCTCTTT, reverz:

ACATACAAGTTGGAAATTTCTGG; IDH2 4. forward:

TCTAGACTCTACTGCCTTCCTC, reverz: GTCAGTGGATCCCCTCTCCA) és tisztítás után szintén direkt szekvenálás (BigDye 3Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, Genetic

Analyser 3500 – Applied BioSystem) történt az intézet Molekuláris Onkohematológia Laboratóriumában.

III.6.2. PCR vizsgálatok (mRNS, miRNS expresszió analízis)

Az RNS-t (Qiagen) PureLink Micro-to-Midi RNS-izoláló kittel, a miRNS-t mirVanaTM miRNA izoláló kittel (Ambion, St. Austin, US) izoláltuk, majd felhasználásig -70^oC-on tároltuk. Expresszió vizsgálatkor 0,25-1 µg RNS-ből MMLV reverz transzkriptázzal (Invitrogen) és random hexamer primerekkel (Invitrogen) cDNS-t készítettünk. RedTaq (Sigma) vagy FailSafeTM (Epicentre Technologies) polimerázzal a primereknek (NOTCH1 sense (s) 5' ACT TCC ACT GCG AGT GCC antisense (as) 5' AGG CAA CGG TAG AAG CCT AG antisense 5′GAG AGC CTG TGT CCA T; Smad3 s 5′AAC AAG AAT GCA GCA GTG GA as 5′ATG GTG CAC ATT CGG GTC AA; Smad4 s 5′GTG GAA TAG CTC CAG annellálási hőmérséklet mellett 26-30 amplifikációs ciklus után a termékeket 1,5 %-os, etídium-bromidos agaróz gélben választottuk szét és Kodak Image Station 4000 MM kamerával dokumentáltuk az eredményeket. Valós idejű PCR-hez TaqMan Assay-On-Demand Gene Expression (ABI) termékeket használtunk (HES-1: Hs00172878_m1, HERP1:

Hs01012057_m1; NRARP: Hs01104102_s1; TIEG: Hs00921811_m; c-myc:

Hs00153408_m1, TIEG: Hs00921811_m; c-myc: Hs00153408_m1). A génexpresszió relatív értékét a belső kontrollként szolgáló β-aktin, GAPDH háztartási gének expressziós szintjéhez (TaqMan Control Reagents, ABI) normalizáltuk.

A miRNS-ek esetében cDNS TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit és Taqman MicroRNA Assay Kitekben található stem-loop RT primereket használtuk [(hsa-miR-16 (Assay ID: 000391), miR-21 (Assay ID: 000397), miR-24 (Assay ID: 000402), hsa-miR-29b (Assay ID: 000413), hsa-miR-128b (Assay ID: 000589), hsa-miR-142-3p (Assay ID:

000464), hsa-miR-155 (Assay ID: 000479), hsa-miR-223 (Assay ID: 000526), RNU6B (Assay ID: 001093). Ezt követően real-time PCR TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) és TaqMan MicroRNA Assay Kitek segítségével határoztuk meg a miR-16, 21, 24, 29b, 128b, 142-3p, 155, 223; belső kontrollként RNU6B szintjéhez (Applied Biosystems) normalizáltunk. A Ct (threshold cycle) értékek alapján kapott eredményeket 7500 software v.1.3.0-, és DataAssist v.2.0 program (Applied Biosystems) segítségével értékeltük. ALL sejtek

esetében egészséges donorok perifériás véréből izolált mononukleáris sejtek (PMNC), T-sejtek, valamint tonsilla palatinából izolált B-sejtek miRNS expresszióját is összehasonlítottuk, melyek esetében a vizsgált miRNS esetében nem találtunk szignifikáns különbséget. Így normál PMNC expresszióját 100%-nak, azaz 1-nek tekintettük az összehasonlításokban. Mivel jelentős különbségeket a vizsgált miRNS-ek esetében a vér és csontvelői mononukleáris sejtek esetében sem találtunk szignifikáns eltérést, ezért perifériás vér és csontvelői mintákat is fel tudtunk használni kísérleteinkben. Pozitív kontrollnak – irodalomi adatok alapján – a vizsgált miRNS-eket fokozottan expresszáló lymphoma (BHD1, diffúz, nagy, B-sejtes lymphoma) sejtvonalat alkalmaztunk.

III.6.3. Smad4 siRNS csendesítés

A Smad4 gén expresszió csendesítéséhez szintetikus siRNS-t alkalmaztunk (sense: r(CAU-CCU-AGU-AAA-UGU-GUUA)dTdT; antisense: r(UAA-CAC-AUUUAC-UAG-GAUG)dAdG; Qiagen); kontrollként fluoreszceinnel jelölt negatív kontroll siRNS-t használtunk (Qiagen). 3 x 10⁶ sejtet 4 ml tápfolyadékban 24 µl HiPerFect reagens (Qiagen) és 24 nM siRNS mellett transzfektáltuk. A transzfekció hatásfokát fluoreszcens negatív kontroll és Smad4 siRNS-el ko-transzfektált mintákból áramlási citometriával határoztuk meg. A Smad4 jelenlétét mRNS szinten RT-PCR-rel vagy, fehérjeszinten Western blottal; illetve a Smad4 aktivitását követő TIEG mRNS expresszió változást RT-PCR vizsgálatával is ellenőriztük.

III.6.4. RICTOR amplifikáció vizsgálatok

A paraffinba ágyazott SCLC minták, illetve az SCLC sejtvonalakból készült sejtblokkok valamint a humán rhabdomyosarcoma esetekben a RICTOR amplifikációt fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) segítségével mutattuk ki. A deparaffinálás Vysis IntelliFISH (Abbott Molecular) kezelés és proteáz emésztés után RICTOR (#RICTOR-20-OR; Empire Genomics, Williamsville, NY, USA) és speciális 5-ös kromoszóma (Chr5) kontroll (#CHR05-10-GR;

Empire Genomics) próba hibridizációval történt. A reprezentatív területek kiválasztás után zajlott a reakciók értékelése, amiben úgynevezett hotspotokra figyelve két független vizsgáló értékelt legalább 2-2 területen 30 sejtmagot (narancsszínű RICTOR és zöld Chr5 szignálok számolásával), ezek segítségével meghatározhatóvá vált a RICTOR/Chr5 arányt. 4 alatti RICTOR kópiaszám, illetve 2 alatti RICTOR/Chr5 arány esetén a mintákat negatívnak, 6 feletti RICTOR kópiaszám vagy 2 feletti RICTOR/Chr5 arány esetén pozitívnak tekintették. A kettő között bizonytalan értékelést fogadtunk el.

Rhabdomyosarcomák esetében a bizonytalan esetek tisztázásához droplet digital PCR technikával beállítottuk az I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben a Rictor amplifikáció vizsgálatot, ehhez ismert Rictor amplifikációval rendelkező, illetve ezzel nem rendelkező tüdő sejtvonalakat használtunk fel. Droplet digital PCR (ddPCR) vizsgálathoz a DNS-t 10-μm vastag paraffinos metszetekből QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Valencia) segítségével izoláltuk; 30 ng DNS-t használtunk RICTOR FAM probe (dHsaCNS608884235; Bio-Rad) and AP3B1 HEX (dHsaCP2500348, Bio-Rad) próbákkal. A dropletek Bio-Rad Automated Droplet Generator (Bio-Rad) készülék segítségével készültek, a mérés 96-os platen C1000 Touch thermal cycler-el (Bio-Rad) (95°C 10 min, majd 40 ciklus - 94°C 30 s, 60°C 1 min, és 98°C 10 min) zajlott. A leolvasást Bio-Rad QX200 droplet reader,

az analízist QuantaSoft szoftverrel (version 1.2.10; Bio-Rad) végeztük. Ha a RICTOR/AP3B1 arány 2 vagy annál magasabb értéket mutatott abban esetben értékeltük amplifikáltnak az esetet.