Expresszió vizsgálatok fehérje szinten

III.7.1. TGF, p-4EBP1 illetve p-S6 ELISA mérések

Az ELISA kitek leírásának megfelelően 1 millió sejtet 100 μl proteáz és foszfatáz gátlókat tartlamazó lízis pufferben lizáltuk, majd meghatároztuk a fehérjetartalmat. Szendvics ELISA kitet használtunk a p-4EBP1 – Thr37/46, p-S6 detektálására (PathScan-ELISA kit, Cell Signaling), illetve a TGF mennyiségi meghatározáshoz Human TGF ELISA kitet (Invitrogene BMS249-4)alkamaztunkgyártók utasításainak megfelelően. Az abszorpciót és az optikai denzitást (OD) 450 nm-es hullámhosszon mértük.

III.7.2. Western blot és WES Simple analízis

Western blot vizsgálatainkban a sejteket a legtöbb esetben SDS mintapufferben lizáltuk majd a vizsgálandó fehérjének megfelelően 10-50 µg mennyiségű fehérjét 8-15%-os SDS gélen elektroforézissel választottunk el és PVDF membránra (Bio-Rad) blottoltuk. Blokkolást követően a membránt primer ellenanyagokkal inkubáltuk egy éjszakán át 4°C-on. Másodlagos ellenanyagként Vectastain Elite ABC másodlagos előhívó kitet (Vector) használtunk, majd a membránokat kemilumineszcens előhívás után (ECL Western Blotting Substrate, 54 Pierce) KODAK Image Station 4000 MM kamerával (Eastman Kodak) vagy vizsgálataink egy részében és jelenleg C-digit (LI-COR) fotódokumentációs rendszerrel fényképeztük, majd denzitometráltuk az eredményeket. Loading kontrollként, illetve a minták összehasonlításának biztosítása érdekében β-aktin exresszió vizsgálatot is végeztünk reblottolással.

Legújabb vizsgálatainkban WES Simple fehérje mennyiségi összehasonlításokat WES System (ProteinSimple-Biotechne 004–600) készülékben kapilláris elektroforézissel 12–230 kDa-os modulon (ProteinSimple SM-W004) anti-nyúl (ProteinSimple DM-001) és anti-egér előhívó kittekkel (ProteinSimple DM-002), szükség szerint HRP konjugált anti-egér IgG antitestekkel detektáltuk a primer antitest kötött fehérjéket. A saját beállításaink alapján kombinálható elsődleges antitesteknek megfelelően 0,2 vagy 1 μg/μl fehérje koncentrációjú sejtlízátumok ~2 μl-ének felhasználása mellett a protokoll leírásnak megfelelően akár 3-4 fehérje analízését végeztük el egy-egy kapillárisban alapértelmezett beállítások mellett. Az elektroferogrammokat ellenőriztük, majd szükség szerint az automatikus csúcsérzékelést manuálisan korrigáltuk, hogy Western blothoz hasonló dokumentációkat vagy denzitometrált, normilalizált, a fehérjék mennyiségét jellemző értékeket határoztunk meg. Ezek segítségével a kezelt és kezeletlen, vagy más összehasonlítandó minták fehérje expressziós változásait igen kis mennyiségű rendelkezésre álló minta esetében is el tudtuk végezni. A vizsgálatokban felhasznált ellenanyagokat egy az immunhisztokémiai vizsgálatok hígításait is tartalmazó közös táblázatban foglaltam össze (5. Táblázat).

III.7.3. In situ fehérje expressziós vizsgálatok (IHC, immuncitokémia, fluoreszcens immuncitokémia és Duolink módszerekkel)

III.7.3.1. Immuncitokémia, fluoreszcens immuncitokémia, Duolink

Sejtvonalakból készített egysejt szuszpenziós mintáink, illetve izolált leukémia sejtek esetében gyakran készítettünk cytospin lemezeket, ill. Az adherens sejtvonalak esetében fedőlemezre vagy labtek lemezekre növesztett sejteket használtunk fel immuncitémiai vizsgálatainkban.

Ezeken adott fehérjék expressziójának vizsgálatát, a fehérje intracelluláris lokalizációjának meghatározását peroxidáz előhívórendszer esetében diaminobenzidin (DAB) reakcióval (barna) hematoxilin háttérfestés mellett vagy fluoreszcens jelzett másodlagos ellenanyagok felhasználásával és DAPI háttérfestéssel vizsgáltuk. A lemezek fixálása általában metanolban zajlott, de természetesen az elsődleges ellenanyag, illetve a várható lokalizáció is befolyásolta ezt. Az elsődleges ellenanyagokat éjszaka, 4ºC-on vagy 90 percig szobahőn használtuk, majd majd másnap peroxidáz vagy floureszcensen jelzett másodlagos előhívó rendszereket alkalmaztunk (pl. Novolink polimer rendszer vagy Vectastain előhívás). Az áramlási citometriai vizsgálatokhoz folyadék fázisban is végeztünk jelöléseket pl. foszfo-S6 és anti-foszfo-Hiszton-H3 ellenanyagok esetében. Áramlási citometriával 5-20 ezer sejt átlagos fluoreszcencia intenzitását (MFI) is meghatároztuk az összehasonlítások vagy expresszió változások értékelése esetében. Ugyanezen mintákat szükség szerint konfokális mikroszkóppal is analizálhattuk DAPI magfestéssel kombinálva.

Duolink festésekben, egymással komplexben, megfelelő távolságon belül található fehérjék vagy egy fehérje pl. foszforilált formája mutatható ki kvantitatív értékeléssel kiegészítve.

Ezekben a vizsgálatokban a natív cytospineket 4%-os paraformaldehidben 10 percig fixáltuk, majd permeabilizáltuk, és blokkolás után kétféle elsődleges ellenanyaggal 2 órán keresztül inkubáltuk (riboszómális S6 és p-S6 – Cell Signaling –, illetve Rictor és mTOR – Bethyl – eltérő forrású „nyúl, illetve egér” ellenanyagok) a lemezeket. A primer ellenanyagok kötődését követően, gyári oligonukleotidokkal jelzett másodlagos ellenanyagokkal inkubáltuk a lemezeket. Ezek az úgynevezett meghatározott oligokkal konjugált anti-egér, anti-nyúl ellenanyagok (PLA – proximity ligation assay ellenanyagok), amelyek abban az esetben, ha megfelelő, 200 nm távolságon belül helyezkednek el, ligálhatóak. Majd egy cirkurális amplifikációs reakció segítségével megsokszorozhatók, és egy hibridizációs próba segítségével láthatóvá, szignálonként számolhatóvá tehetők, elemezhetők. A digitális képeken (pl.

BlobFinder programban), így a komplexben levő fehérjék vagy a kis mennyiségben jelenlevő fehérje változatok expressziójának kvantitatív meghatározása egy sejtre vonatkoztatva is lehetséges.

III.7.3.2. Immunhisztokémia

A paraffinos blokkokból készült biopsziás vagy TMA metszeteket deparaffináltuk, majd endogén peroxidáz blokkolás után az antigéneket megfelelő pufferben (leggyakrabban citrát pH 6 vagy ritkábban TRS, EDTA pH 9) elektromos kuktában (21 perc) tártuk fel. A metszeteket lószérumos blokkolás után az elsődleges ellenanyagok meghatározott hígításaival (5. Táblázat) éjszaka 4˚C-on nedves kamrában inkubáltuk. Majd Novolink (Novocastra), illetve Vectastain (Vector) másodlagos előhívó rendszereket használtunk, DAB kromogénnel, hematoxilin háttérfestés mellett. Immunhisztokémiai vizsgálataink során, teljes biopsziás mintákat, sejtblokkokat és több független TMA (tissue micro array) blokk sorozatot vizsgáltunk.

Utóbbiak készítéséhez az I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet archivált formalinban fixált, paraffinba ágyazott biopsziás mintáiból gyűjtöttünk blokkokat és a reprezentatív területekből 2 mm átmérőjű szövethengereket szúrtunk ki és illesztettünk be a 70 mintás TMA blokkokba.

Az IHC vizsgálatokat legalább két független patológus segítségével értékeltük. A szöveti mTOR aktitás vizsgálatokban leggyakrabban (pl. a lymphomák és coloncarcinomák esetében) a mTOR, S6, p70S6K, illetve 4EBP1, és amennyiben lehetőség volt a p-Ser473-Akt festéseket +, ++, +++-el értékeltük. Pl. lymphomákban a p-p-Ser473-Akt (mTORC2 target) festések nem működtek megbízhatóan (valószínűleg amiatt, mert a molekuláris vizsgálatok miatt a szövetek natívan érkeznek), míg más szolid daganatok esetében ennek a festésnek az értékelése is lehetséges. Belső kontrollnak az értékelésnél a plazmasejteket tekintettük, ezek magas mTOR aktivitása, igen intenzív IHC jelölődést eredményezett a p-mTOR és p-S6 festések esetében, ezt tekintettük +++ intenzitású értéknek. Tumorok esetében általánosan, ha a daganatsejtek több mint 10%-a már mutatta a magasabb intenzitású festődést, akkor azt a magasabb értéket társítottuk az esethez. Jellemzően magas mTOR aktivitásúnak azokat az eseteket érékeltük, ahol az mTOR aktivitását jelző markerek közül ++ vagy +++

értékelést kapott legalább kettő. A lympomákat érintő vizsgálatainkban egy lymphoma típust abban az esetben értékeltünk jellegzetesen magas mTOR aktivitásúnak, ha a vizsgált esetek több mint 50%-ában magas mTOR aktivitást határoztunk meg. A Rictor és Raptor festődése általában nem mutatott tumoron belül heterogenitást, így a festődés intenzitását lymphomák esetében az előbbihez hasonlóan értékeltük, és a két intenzitás különbségei alapján az mTORC1-mTORC2 eltolódást tudtuk értékelni. Abban az esetben állapítottuk meg valamelyik mTOR komplex dominanciáját, ha legalább + eltérést tapasztaltunk a két festés értékelésében.

Számos esetben, amikor pl. a metabolikus fehérjék in situ festéseit értékeltük az előbbiek mellett H-score értékelést is végeztünk, a H-score értéket 0 és 300 között úgy számoltuk, hogy a festési intenzitást (0-3 +) megszoroztuk az egyes sejtek intenzitásának százalékával (0-100%).

H-score = 1 × (1+ intenzitással festődő sejtek %-a) + 2 × (2+ intenzitással festődő sejtek

%-a) +3 × (3+ intenzitással festődő sejtek %-a) (299). A végső H-score értéket az esethez tartozó TMA core-ok (több független értékelés) H-score értékeinek áltagával adtuk meg. Abban az esetben ahol ennek segítségével alacsony és magas expresszió értékelést adtunk, ott cut-off értékeket határoztunk meg a medián H-score értékek segítségével. A medián alatti értékű eseteket alacsony, míg a mediánnal megegyező vagy afeletti H-score értékkel rendelkező eseteket magas expressziójúnak tekintettük.

A SLCL Rictor amplifikációs vizsgálatunkban a p-Akt immunhisztokémiai reakciók értékelés, mint IHC előszűrési módszer alkalmasságát is teszteltük. A korábban leírt H-score értékelés helyett az egyszerűbb, csak a pozitív sejtek %-os arányának meghatározásán alapuló módszert vettük figyelembe. Az erősebb intenzitással festődő területekre koncentráltunk és ott legalább 500 daganatsejt vizsgáltunk. A RICTOR amplifikációval összevetve az immunhisztokémia szenzitivitását és specificitását is vizsgáltuk a Rictor és p-Ser473-Akt festéseket, ahol a kategóriákat negatív (nincs/alacsony expresszió), illetve pozitív (közepes/magas expresszió) csoportokba soroltuk.

5. Táblázat A különböző módszerekben (immunhisztokémiai festések - IHC, immuncitokémia - ICC, Western blot - WB, Wes Simple WES) felhasznált ellenanyagok listája, azonosítói és adott módszer esetében alkalmazott hígítása

antitest azonosító gyártó IHC ICC WB WES felhasználás oka

mTOR #2972 Cell Signaling Technology 1:100 1:100 1:100 1:50 mTOR kináz mennyisége p-mTOR (Ser2448) #2976 Cell Signaling Technology 1:100 1:1000 1:50 mTOR aktív formája

Raptor #89603 / 623202 Novus / Biolegend 1:100 1:500 1:50 mTORC1 komplex mennyisége

p-4EBP1 #2855 Cell Signaling Technology 1:50 mTORC1 aktivitás jele

p-p70S6K #9234 Cell Signaling Technology 1:100 1:500 mTORC1 aktivitás jele p-S6 (Ser 235/236) #2211 Cell Signaling Technology 1:100 1:100 1:1000 1:50 mTORC1-p70S6K aktivitás

S6 #2317 Cell Signaling Technology riboszomális S6

Rictor #2140 / #A500-002A (1G3P2C9)Cell Signaling Technology 1:1000 1:10001:1000 1:50 mTORC2 mennyisége p-(Ser473)-Akt #4060 (D9E) Cell Signaling Technology 1:100 mTORC2-aktivitás jele

pan-Akt #2920 Cell Signaling Technology 1:1000 Akt teljes mennyisége

p-HistonH3 #9701 Cell Signaling Technology 1:50 mitotikus sejtek kimutatás cleaved-caspase 3 #9661 Cell Signaling Technology 1:50 1:500 apoptotikus sejtek

kimutatása, aktív kaszpáz 3

Bcl-2 Dako 1:50 1:1000 anti-apoptotikus fehérje

Bcl-XL ^MA5-15142 Invitrogene 1:50 1:1000 anti-apoptotikus fehérje

Bax 127606 Novus 1:1000 pro-apoptotikus fejhérje

Bid ^MA5-32642 Invitrogene 1:1000 pro-apoptotikus fejhérje

HK2 #2867 Cell Signaling Technology 1:1000 1:50 glikolízis

p-AMPK #2535 Cell Signaling Technology 1:100 1:1000 1:50 AMPK-aktiv formája

GLUT1 ab652 Abcam 1:400 glükóztranszporter

GAPDH ab8245 (6C5) Abcam 1:600 glikolízis

ATPB ab14730 (3D5) Abcam 1:100 oxidatív foszforiláció

CPT1A ab128568 (8F6AE9) Abcam 1:500 1:1000 1:50 zsírsavak béta-oxidációja

MCT1 A304-358A Bethyl 1:100 laktát- és acetátfelvétel

ACSS2 #3658 (D19C6) Cell Signaling Technology 1:200 acetáthasznosítás

GLS ab156876 (EP7212) Abcam 1:200 1:50 glutaminolízis

LDHA #3582 Cell Signaling Technology 1:400 1:1000 piruvát-laktát átalakítás

LDHB #85319 Abcam 1:2000 laktát-piruvát átalakítás

PFKP #8164 Cell Signaling Technology 1:100 1:50 glikolízis

ASCT2 #A304-353A Bethyl 1:2000 glutamintranszport

LC3 #110-57179 Novus 1:50 autofágia marker

GAT1 ab426 Abcam 1:50 GABA-transzporter

SSADH #129017 Abcam 1:500 1:1000 aminosav anyagcsere

FASN #3180 Cell Signaling Technology 1:100 1:1000 1:50 zsírsavszintézis

COXIV #4880 Cell Signaling Technology 1:50 terminális oxidáció,

elektrontranszport lánc 4

G6PDH ab133525 Abcam 1:100 glikolízis

ALDH1A1 #54135 Cell Signaling Technology 1:50 őssejtmarker

p-Acly #4331 Cell Signaling Technology 1:1000 1:50 zsírsavszintézis

PDH #3205 Cell Signaling Technology 1:1000 1:50 piruvát-acetil-KoA átalakulás c-Notch1-1 #2421 Cell Signaling Technology 1:100 1:1000 aktív Notch szignál jele,

hasított Notch-1 fehérje

NICD NBP1-48289 Novus 1:1000 teljes Notch és hasított Notch

fehérjék

Smad2 sc-393312 Santa-Cruz 1:500 Receptor asszociált Smad

Smad3 sc-101154 Santa-Cruz 1:100 1:1000 Receptor asszociált Smad

p-Smad2 #3108 Cell Signaling Technology 1:100 1:1000 aktivált Smad2

Smad4 sc-7966 Santa-Cruz 1:1000 Co-Smad

Smad6 sc-25321 Santa-Cruz 1:500 inhibitor Smad

Smad7 sc-365846 Santa-Cruz 1:500 inhibitor Smad

p-JNK #4668 Cell Signaling Technology 1:1000 aktív JNK

p-ERK1/2 #4370 Cell Signaling Technology 1:2000 aktív Erk

p-p38 MAPK #4511 Cell Signaling Technology 1:1000 aktív p38 MAPK

b-aktin a2228 Sigma-Aldrich-Merck 1:2000 1:50 WB/WES loading kontroll

metabolikus vizsgálatokjelátviteli folyamataok vizsgálatamTOR komplx elemei vagy aktivitását jelző foszfo- proteinek proliferáció, apoptózis vizsgálataok

III.8. Metabolikus folyamatok karakterizálásához beállított és felhasznált analitikai és

In document MTA Doktora pályázat Jelátviteli zavaroktól az onkometabolizmusig – daganatsejtek bionergetikai alkalmazkodása Sebestyén Anna (Pldal 57-61)