A vizsgálatokban érintett betegcsoportok és jellemzőik, etikai engedélyek

Munkáinkban arra törekedtünk, hogy az in vitro vagy in vivo kísérleteinkben megfigyelt daganatbiológiai jelenségeknek diagnosztikai, terápiás jelentőségére is rá tudjunk mutatni.

Ennek lehetőségét teremtette meg számunkra az egyetem patológiai intézeteiben archivált tumorszövetek sokfélesége és a Magyar Tudományos Tanács Országos Tudományos Kutatási Etikai Bizottságának jóváhagyása, állásfoglalása (7/2006. Sz.), amelyhez adott vizsgálatok esetében szükség szerint további ETT-TUKEB vagy egyetemi kutatási etikai bizottsági engedélyekkel is rendelkeztünk, rendelkezünk (TUKEB 118/1999; TUKEB 510/2013, 86/2015, TUKEB 99/2018., 14383-2/2017/EKUB). LAM és SCLC esetében a Mayo Klinika segítségével zajlottak vizsgálataink, a Mayo Klinika hivatalos engedélyeinek megfelelően (IRB#: 18-001887, IRB#: 15-000406). Vizsgálatainkban különböző daganatos betegségek humán mintáit használtuk fel, egyes esetekben szükség és lehetőség szerint a betegek követéses klinikai vagy túlélési adatait használtuk fel.

A vesetranszplantációs beavatkozások daganatos szövődményeinek elemzéséhez a budapesti veseátültetés kezdetétől 1973-2008 között a Semmelweis Egyetem I.sz. Sebészeti Klinikáján, illetve később Transzplantációs és Sebészeti Klinikáján végzett közel 3000 veseátültetés kórtörténeteit tekintettük át Dr. Végső Gyula transzplantációs sebész kollégával.

Retrospektív feldolgozásunkban az átlagos követési idő 94,1 hónap volt, a 193 beteg esetében felismert rosszindulatú daganatok megoszlását elemeztük és foglaltuk össze (férfi/nő arány 2,2:1, átlagéletkora 53,1±10,1 év, a donor és recipiens HLA eltérés átlaga 2,83±0,6).

Összehasonlító elemzésünkben a lakosság körében előforduló rosszindulatú daganatok incidenciáját a Magyar Nemzeti Rákregiszter adatai alapján szintén áttekintettük. A 4 különböző immunszuppresszív gyógyszerkombináció alkalmazásának jelentőségét is vizsgáltuk. Ezt a munkát egészítettük ki egy hamarosan közlésre kerülő a poszttranszplantációs és a de novo kialakuló vesedaganatok mTOR aktivitását összehasonlító vizsgálatunkkal.

Utóbbiban 46 de novo és 44 poszttranszplantációs vesedaganat, illetve 10 végállapotú

vesebiopsziás-minta, archivált paraffinos minták mTOR aktivitását jellemző IHC reakciók eredményeit elemeztük.

Vizsgálataink jelentős részében Kopper professzor munkacsoportjának hagyományait folytatva leukémiák és lymphomák szabályozatlan növekedésének és apoptózis rezisztenciájának hátterében a Notch szignál, illetve mTOR aktivitásváltozásokat tanulmányoztuk.

B-sejteket illetve B-CLL sejteket 24 CLL-es beteg, valamint egészséges normál donorok alvadásgátolt perifériás véréből izoláltuk. A diagnózis az aktuális WHO klasszifikáció kritériumainak megfelelően történt, a Rai-féle stádiumbeosztást alkalmaztuk, feldolgoztuk továbbá az egyéb klinikai adatokat is (kor, nem, hemoglobin, lymphocytaszám, thrombocytaszám, alkalmazott terápia és progresszió) elemzéseinkben.

A Semmelweis Egyetem II. sz. Gyermekgyógyászati Klinika Hematológiai osztályával együttműködésben 2008 és 2012 között kezelt 79 ALL-es betegek csontvelői és perifériás vér mintáiból előbbiekhez hasonlóan gyűjtöttünk ALL, illetve a terápiás követést követően repopulálólódó sejteket csontvelői/perifériás mononukleáris sejteket (n=372) az I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben. Összesen 25 gyermeknél a kezelés valamennyi fázisából; (0.

napi, kezeletlen minta, kemoterápia 15. napi, 33. napi, és protokoll M előtti időpontok) (n=100) tudtunk elemezhető mennyiségű mintát gyűjteni, illetve még 28 beteg beteg esetében a diagnóziskori mintákat tudtuk felhasználni mTOR aktivitás és miRNS expresszió vizsgálatainkban (az összes eset között 9 T sejtes ALL volt).

A lymphomás szövetek IHC vizsgálataiban teljes vagy TMA blokkok készítése után készített metszeteket festettünk. Az egyik TMA vizsgálatban 2004- 2008 közötti az aktuális lymphoma klasszifikáció szerinti besorolásoknak megfelelő 104 lymphoma mintát dolgoztunk fel (23 Hodgkin – HL, 10 Diffúz nagy B–sejtes – DLBCL, 11 köpenysejtes – MCL, 9 anaplasiás nagy-sejtes lymphoma – ALCL, 4 Burkitt lymphoma – BL, 12 marginális zóna lymphoma – MZL, 13 krónikus lymphoid leukémia/kissejtes lymphocytás lymphoma - CLL, 10 folikuláris – FL és 12 perifériás T-sejtes lymphoma). Majd Hodgkin lymphomás vizsgálatunkhoz az ebben a vizsgálatban szereplő 23 HL biopszia mellé további 60 HL-es beteg mintáját választottuk ki a korábbi 2000-2007 közötti évekből, így összesen 83 HL immunhisztokémiai vizsgálatát végezhettük el (reprezentálva a HL altípusokat: 7 noduláris lymphocyta predomináns HL és 76 klasszikus HL eset; amelyek 47 noduláris sclerosis, 18 kevertsejtes, 8 lymphocyta gazdag és 3 lymphocyta depléció esetet jelentettek). A DLBCL-ek mTOR aktivitásának vizsgálatához 80 diffúz nagy B-sejtes lymphomás eset biopsziás mintáiból készült TMA metszeteket használtunk fel, de a követéses klinikai adatok csak 68 esetben voltak elérhetőek. Ezek megoszlása 50 nem (non-GC) és 18 csíracentrum eredetű (GC) DLBCL volt.

Szolid daganatok több típusát is érintették különböző vizsgálataink.

103 (50 nő és 53 férfi) colon carcinomás a műtét után 5-FU és oxaliplatin komplex kezelésben részesült beteg szövettani biopsziás mintáját sikerült összegyűjtenünk 1996 és 2004 közötti időszakból, így ezekben az esetekben a követéses, túlélési adatok elemzésére is sor kerülhetett –minimálisan 5 év betegkövetéssel, illetve a túlélési adatok elemzésékor 10 évvel.

Az átlag életkor 62 év volt – medián 63 év, 34 és 78 év között –, 77 hónap medián túlélés mellett; 72 esetben colon és 31 rektum tumor; 12 Grade I, 64 Grade II és 27 Grade III esetet

érintett a vizsgálat. Dukes és a TNM klasszifikáció szerinti osztályozás alapján - 30 esetben Dukes B2, 8 esetben Dukes C1, 56 esetben Dukes C2 és 9 betegnél Dukes D stádiumú esetünk, illetve 36 II stádiumú, 60 III stádiumú és 7 IV stádiumú beteget különböztethettünk meg.

Többféle tüdődaganat esetében is végeztünk vizsgálatokat. 67 primer tüdő adendocarcinomát és 67 tüdő adenocarcinoma agyi áttétjét érintő mTOR aktivitás vizsgálatunkban; a minták között 15 esetben ugyanazon beteg primer tumor-agyi metasztázis szöveteit is össze tudtuk hasonlítani. A primer adenocarcinoma műtéteket 2003 január és 2011 december között végezték, a szövettani klasszifikáció ellenőrzése, reklasszifikációja a 2015-ös WHO beosztás alapján történt. Egyes klinikopatológiai adatokat is tudtunk elemezni (életkor, nem, stádium, dohányzási anamnézis, az agyi áttétek mérete és száma). Kissejtes tüdődaganatok esetében a Rictor amplifikácó és ezzel összefüggésben az mTOR aktivitás IHC vizsgálatokat 92 beteg 100 archivált mintáiban (80 sejtblokk, 4 transzbronchiális biopszia,16 műtéti reszekátum) a floridai Mayo Klinikával (Jacksonville, USA) kollaborációban elemeztük.

A vizsgálatokat a Mayo Klinika kutatásetikai bizottsága engedélyezte (IRB#: 18-001887). A diagnózisok felállítás a 2015. évi WHO klasszifikáció alapján zajlott. A betegek a mintavétel nem kaptak kemoterápiás kezelést. Az előbbi együttműködés keretein belül kerülhetett sor a rendkívül ritka lymphoangioleiomatosisos (LAM) betegek tüdőszöveteinek mTOR és metabolikus jellegzetességeinek vizsgálatára is. 11 S-LAM beteg műtéti formalin-fixált paraffinba ágyazott tüdőszöveteit vizsgálhattuk meg, 4 esetben diagnosztikus mintavételi és 7 esetben az explantált tüdő minta állt rendelkezésünkre. A műtéteket 2004. január 1-je és 2016.

december 31-e között végezték a Mayo Klinikán. Ebben az esetben is rendelkeztünk a Mayo Klinika kutatásetikai bizottságának engedélyével (IRB#: 15-000406). Két beteg esetében ugyan hormonterápiát alkalmaztak, de egy beteg sem kapott mTOR gátló kezelést a műtétek előtt. A LAM szövetekben a legalább 100 LAM-sejtet tartalmazó LAM-nodulusokat értékeltük és ismert prekurzor sejtek hiányában kontrollként a normál bronchiális simaizomsejtekkel (BSM) hasonlítottuk össze a jellegzetes in situ expresszió különbségeket.

Gliomákat érintő metabolikus vizsgálatainkkal összefüggésben glioma biopsziás mintákból TMA-t készítettünk, amelyben összesen 47 esetet használhattunk fel (IDH1 R132H mutáció 32 esetben volt a vizsgált 14 astrocytoma, 14 oligodendroglioma, 19 glioblastoma között; nemek megoszlása 23/24 nő/férfi; grádus szerinti megoszlás: II n=9, III n=19, IV n=19), normál kontrollként az agy három különböző régiójából származó területet értékeltünk összehasonlító elemzéseinkben.

Magyar gyermekonkológiai központokban 2007. és 2017. között rhabdomyosarcoma miatt kezelésben részesült betegek anyagait 19 patológiai intézet segítségével gyűjtöttük össze mTOR aktivitás és metabolikus profil vizsgálatainkhoz (ez 48 beteg 65 szövettani mintáját eredményezte). Így, végül 53 embrionális, 7 alveoláris és 5 botrioid, vagy orsósejtes altípusba tartozó eset vizsgálatára kerülhetett sor TMA vizsgálatainkban, azokban az esetekben ahol nem volt lehetőség a kis mennyiségű rendelkezésre álló szövetminta miatt TMA készítésre ott hagyományos immunfestéseket végeztünk a szöveteken. Egyes betegek esetében mintapárok is rendelkezésre álltak, aminek segítségével az adjuváns kezelések esetében, illetve a kezelést követően a recidívákban bekövetkező mTOR és metabolikus változások jellemzésére is sor kerülhetett (8, illetve 9 párosított eset).

Emlődaganatok metabolikus jellemzéskor a különböző szubtípusokból (Luminal A, Luminal B, HER2+ és tripla negatív (TNBC)) 20-20 esetet vizsgáltunk teljes biopsziás

metszetekben a normál emlőszövetekkel összehasonlítva (a tumortípusok meghatározása a 2013-as St.-Gallen-i Konszenzus ajánlása alapján zajlott) az egyetem II. Patológia Intézete, Kulka Janina professzor asszony és Tőkés Anna-Mária tudományos főmunkatárs segítségével.

A primer daganatokat 1999. augusztus és 2019. december között távolították el, a betegek előzetes kezelésben nem részesültek. A távoli metasztázismentes túlélést (DMFS) és a teljes túlélést (OS) is vizsgáltuk összehasonlító elemzésünkben.

Amennyiben TMA blokkokat készítettünk, akkor legalább két, de több esetben három, vagy akár négy szövethengert is szúrtunk azonos blokkból a patológusok által megjelölt jellegzetes tumor területeket érintve. Előbbiek mellett szöveti „normál” kontroll szöveteket (colon, nyirokcsomó, máj, vese), illetve orientációs és immunhisztokémiai pozitív-negatív kontroll szöveteket is tartalmaztak a TMA blokkok. A TMA-IHC festések értékeléséhez 3DHistech Panoramic Viewer Programot és/vagy hagyományos fénymikroszkópot használtuk, az elemzésekben minden esetben legalább két független patológus vett részt az értékelésben.

Amennyiben a vizsgálók adott értékeléseiben nagy eltérés jelent meg, akkor közösen további patológusok segítségével is újraértékeltük az adott festéseket. Az értékelésben használt score-meghatározásokat az immunhisztokémiai leírásoknál mutattam be.