Gyermekkori akut lymphoid leukémia sejtek jellemző mTOR hiperaktivitása és

Az akut lymphoid leukémia (ALL) a leggyakoribb gyermekkori malignus kórkép. Molekuláris genetikai eltérések az ALL-es lymphoblastok 70-80%-át jellemzik, ezek, mint független tényezők módosítják a betegek prognosztikai besorolását, meghatározzák kezelésüket (jobb prognózissal – 4-es, 7-es, 10-es triszómia, hyperdiploiditás, ETV6-RUNX1 transzlokáció –, illetve rossz prognózissal összefüggő – transzlokációk: pl. BCR-ABL1, TCF3-PBX1, MLL-AF4;

21-es kromoszóma intrakromoszómális amplifikációja, hypoploiditás – molekuláris eltérések) (323-331). Az azonosított molekuláris változások célzott terápiás lehetőségeket is jelentenek (Ph+ ALL-es betegek tirozin-kináz gátló kezelése) (332). Az életkor, a kezdeti fehérvérsejtszám, az immunfenotípus, a központi idegrendszer érintettsége/hiánya, cytogenetikai eltérések és a 8. napi szteroid válasz alapján az ALL-es gyermekeket rizikó besorolásuknak megfelelően kezelik (SR, MR, HR). A 15. napi blasztok magas arányának is terápiás következménye van. Annak ellenére, hogy a 2 évig tartó kezelések eredményei igen jók a betegek 20%-ában recidíva alakul ki, és még a legmodernebb kezelések, az allogén őssejtátültetés kombinációja mellett is a betegek 15-20%-át veszítjük el. Ennek leggyakoribb oka a kialakuló terápia rezisztencia, recidíva. Fontos, hogy a terápia közben, illetve azt követően fellépő mellékhatásokat is kezelni kell, mivel 50%-ban krónikus egészségügyi probléma léphet fel (334-336).

A Semmelweis Egyetem II. sz. Gyermekgyógyászati Klinika Hematológiai osztályával együttműködve 2008 és 2012 között kezelt ALL-es betegek (n=79) csontvelői és perifériás vér mintáiból izolált sejteket gyűjtöttünk (n=372) az I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben. Összességében 25 gyermek esetében a kezelés valamennyi fázisából (0. napi,

kezeletlen minta, kemoterápia 15. napi, 33. napi és protokoll M előtti időpontok) (n=100) gyűjtött minták, illetve még 28 beteg esetében a diagnóziskori minták álltak rendelkezésre.

Kétféle ELISA (p-S6 és p-4EBP1) mérés eredményeit felhasználva izolált normál perifériás lymphocyták, B- és T-sejtek mTOR aktivitását vetettük össze ALL sejtvonalak mTORC1 aktivitásával (10. táblázat). A leukémia sejtekben jelentős mTOR aktivitás emelkedést igazoltunk. Mivel a p-4EBP1 ELISA esetében a mérési tartományok sokkal megbízhatóbb eredményeket mutattak, ezért az izolált humán leukémia sejtekben meghatározásainkat a p-4EBP1-szint mérésekkel folytattuk.

10. Táblázat mTOR aktivitást jellemző p-S6 és p-4EBP1 fehérjék mennyiségének vizsgálata ELISA-val.

Normál B-, illetve T-sejtek expressziójához viszonyított változásokat, mint relatív OD értéket adtuk meg T-ALL (Jurkat, CEM) és B-ALL sejtvonalakban (Nalm6, Mn60).

Ezt követően izolált gyermekkori ALL sejtek fokozott mTOR aktivitását vizsgálva igazoltuk, hogy a p-4EBP1 egy meghatározható cut-off értéknél magasabb expressziós értékei szignifikánsan összefüggnek a rosszabb prognózissal (11. táblázat). Egyes primer izolált ALL sejtek mTOR inhibitor érzékenységét in vitro short-term tenyészeteinkben is teszteltük. Ezek egy részében az mTOR gátló jelentős apoptózist indukáló hatását figyeltük meg, míg más esetekben (ezeknél a betegeknél egyébként később recidíva alakult ki) a rapamycin ilyen hatását nem tudtuk kimutatni.

11. Táblázat ALL-es betegek mTOR aktivitás ELISA eredményei és a klinikai adatok; § – a p-4EBP1 ELISA OD cut-off érték (OD=1,1); # – életkor a diagnózis megállapításakor; ** – a hyperdiploid csoportba két beteg, ETV6/RUNX1 fúzióval; *** – prognózis meghatározása lásd korábban a szövegben; & – a betegek állapota a vizsgálat befejezéséig. (SR – alacsony, IR – közepes, HR – magas rizikójú kezelési ág; φ – Fisher exakt és χ – chi2 tesztek; π – szignifikáns korreláció az mTOR aktivitással)

esetszám % alacsony mTOR

kariotípus **, π normál hiperdiploid

rossz prognózisra utaló genetikai elt.

24 49 24 71 7 29

21 43 20 95 1 5 <0,5

4 8 1 25 3 75

prognózis ***, π jó

rossz

37 76 33 89 4 11 <<0,05

12 24 4 33 8 67

jelen állapot & π SR

IR HR

21 43 20 95 1 5

16 33 13 81 3 19

5 10 10 60 2 40 <<0,05

Az érzékenységkülönbség hátterében eredményeink szerint az mTORC1, illetve C2 komplexek egyedi aktivitás különbségei állhattak; a vizsgált rezisztens esetekben jelentős Rictor expressziót igazoltunk a háttérben. In vitro nemcsak rapamycin kezeléseket, hanem különböző kombinációs kezeléseket is teszteltünk. Az mTOR gátló rapamycin kezelés fokozta a kemoterápiás készítmények proliferáció gátló és apoptotikus hatásait. (42. ábra)

42. ábra Gyermekkori ALL-es sejtek mTOR hiperaktivitása, annak prognosztikai szerepe, és ezzel összefüggő terápiás lehetőségek. A jó és rossz prognózisú ALL-es betegek mTOR aktivitását jellemző p-4EBP1 fehérje szintek (ELISA eredmények; § – a p-4EBP1 ELISA OD cut-off érték (OD=1.1); az mTOR aktivitás érték prognosztikai jelentősége (a.); KM túlélési görbék (alacsony (n=37), illetve magas (n=12) mTOR aktivitással rendelkező esetek besorolása 1.1-es p-4EBP1 cut-off OD értéknél.(p<<0.05; Log-rank teszt) (b.); Két jó prognózisú, illetve két rossz prognózisú ALL-es mintasorozat p-4EBP1 értékei (A relatív OD értékek megadásakor

a normál PMNC sejtek expressziója 1) (c.), illetve rapamycin kombinációs kezelések apoptózis indukáló hatásai izolált leukémia sejtben (DOX - doxorubicin, 100 nM; VCR – vincristin, 10 ng/ml, MTX - methotrexate, 20 nM;

ARA-C: cytarabine, 10 ng/ml, rapamycin, 50 ng/ml; CYCLO - cyclophosphamide, 500 nM; MED - methyl-prednisolone, 100 nM. áramlási citometriai mérések, 72 h kezelés után *p< 0,05.) (d.).

ALL-es minták esetében más lymphomákat érintő vizsgálatok alapján kiválasztott miRNS-ek expresszióját is meghatároztuk (12. Táblázat). Real-time PCR eredményeinket humán perifériás mononukleáris sejtek expressziójával vetettük össze. A vizsgált humán ALL sejtvonalakat miR-128b overexpresszió jellemezte (CEM, Jurkat és Nalm6 több mint 500x relatív expresszió fokozódás). Az „oncomiR”-ként ismert miR-21 és miR-155 közül a miR-21 expresszió egyik vizsgált leukémia sejtvonalban sem emelkedett, míg a miR-155 jelentősebb expresszióját a CEM (T-ALL) sejtvonalban mutattuk ki. T-ALL sejtvonalakban miR-16 overexpressziót, a B-ALL sejtvonalakban a miR-223 expresszió csökkenést tapasztaltunk.

Gyermekkori ALL-es betegek 24 vizsgált mintájában B- és T-ALL fenotípus függő eltéréseket figyeltünk meg. A miR-29b T- és B-ALL-ekben egyaránt csökkent [0,19x (0,001-1,05)], és a miR-21 [0,15x (0,003-0,73)] és miR-223 [0,31x (0,003-1,56)] esetében is alacsony expressziót tapasztaltunk. A miR-155 mérsékelt emelkedése pedig csak a B-ALL-es mintákat jellemezte [5,5x (0,54-11,7)]. Míg, várakozásunknak megfelelően minden esetben szignifikánsan fokozott miR-128b expressziót igazoltunk [409x (17,3-1048)]. Eredményeink esetében a miR-128b expressziós adatoknál meg tudtunk határozni egy olyan cut-off expressziós értéket, amely 75%

szenzitivitással és közel 90% specifitással előre jelezte a diagnóziskori minták vizsgálata esetén a várhatóan rossz prognózisú eseteket (43. ábra).

12. Táblázat A vizsgálatban kiválasztott miRNS-ek és a vonatkozó közlemények adatai. Alacsony ↓ és fokozott ↑ expresszió.

Vizsgált miRNS22 Lehetséges cél molekulák Előfordulás

miRNS 16 BCL2, TIAMI, CDK6, HIF1α és

miRNS 24 MAPK foszfatáz-7, JNK2, p38 kináz ↓ TCF3-PBX1 transzlokációt hordozó pre-B-ALL (344)

miRNS 29b MCL-1, ABL1, BCR/ABL1 ↓ AML, osteosarcoma, tüdődaganat (4345-347)

miRNS 128b EGFR, PTEN

↓ AML, MLL-AF4 (348)

↑ ALL (349), sugárérzékeny NSCLK (350)

miRNS 142-3p cAMP, PKA, GRα, TAB1, MAP3K7

binding protein 2 ↑ humán B-, T-ALL, AML (351-352)

miRNS 155 c-myc, PIK3RI, Smad5, SHIP1

↑vastagbéldaganat, emlődaganat, tüdődaganat (353), hematológiai malignitások (DLBCL, CLL,

Hodgkin-lymphoma) (337)

miRNS 223 E2F1, LMO2, MEF2C, NFIA,

CEBPα, E2A

↓ ALL (348)

↓ AML, MALT (354-356)

43. ábra Gyermekkori ALL-minták miRNS expresszió vizsgálata (real-time PCR). A miRNS-ek expresszióját az izolált PMNC sejtekhez viszonyítva adtuk meg (* p<0,05) (a.); Jó- (n=16) és rossz (n=8) prognózisú esetek mintáinak

relatív miR-128b

expressziója (normál lymphoid sejtekhez viszonyítva; *p<0,05) (b.);

miR-128b expresszió prognosztikai szerepének vizsgálata. A cut-off értéket (80x) ROC analízissel határoztuk meg (ennek szenzitivitása 75%, specifitása 87,5%) (c.).

IV.3. mTOR aktivitás változások és azok jelentősége bizonyos szolid daganatokban,