Humán coloncarcinoma esetek mTORC1 és C2 komplex-függő mTOR

Vizsgálataink megkezdésekor a coloncarcinomák kezelésében a célzott anti-VEGF terápia (bevacizumab, aflibercept) vagy az anti-EGFR-terápia (cetuximab, panitumumab) még általában oxaliplatin-alapú kombinációkra korlátozódott (357), bár a PI3K/AKT/mTOR útvonal szabályozási zavara nem volt ismeretlen, ebben a daganattípusban. Felmerült az érintett útvonalak kombinált célzása, köztük az mTOR kináz gátlása everolimus-szal (RAD001) a klinikai eredmények javítása érdekében, de csak minimális terápiás előnyöket értek el. Azt hangsúlyozták, hogy az mTOR gátló monoterápia nem elég hatékony (358) és az érdeklődés a duál mTOR inhibitorok felé irányult ebben az időben (359). Meglepő volt azonban, hogy az mTORC1 és C2 komplex aktivitások részletes in situ humán szövettani vizsgálata ennek ellenére sem történt meg. Ennek köszönhető, hogy munkánk hiánypótlónak számított a témában.

103 biopsziás minta TMA metszetein részletes mTOR aktivitás elemzést végeztünk mTOR, p-mTOR, p-S6, p-4EBP1, p-AMPK, Rictor és Raptor immunhisztokémiai reakciók és a klinikai adatok értékelésével. A 4EBP-1 és a p70S6K ismert mTOR kináz, mTORC1 komplex targetek, de ezek foszfoproteinjei mellett immunhisztokémiai szempontból megbízhatóbb a p70S6K target, riboszómális S6 fehérje foszforilált forma megjelenésének vizsgálata (p-S6). Így a p-S6, p-4EBP1 és a p-mTOR panel immunhisztokémiai értékeit minden esetben együttesen értékeltük. Az esetek 73,8%-ában magas mTOR (++ vagy +++ pozitivitás) aktivitást mutattunk ki. Az alacsony mTOR aktivitású esetekben (27/103 eset; 26,2%), az egymással jó korrelációt mutató p-S6 és a p-mTOR immunrekaciók negatív vagy maximum + pozitív értékelést kaptak.

76 esetben azonban intenzív p-mTOR expressziót mutattunk ki. Az AMPK ismert, az mTOR aktivitást negatívan befolyásoló szerepe is igazolódott eseteinkben; míg alacsony mTOR aktivitás mellett minden esetben p-AMPK pozitivitást (aktív forma), addig magas mTOR aktivitáskor p-AMPK pozitivitást csak egyetlen esetben tapasztaltunk. Előbbiek mellett a két komplexben karakterisztikus vázfehérje a Raptor-mTORC1 és Rictor-mTORC2 IHC vizsgálatát is értékeltük. Ezek alapján az eseteket 3 csoportba osztottuk: a. Rictor domináns expressziójú – a Raptor fehérje alig volt kimutatható és intenzív Rictor festést tapasztaltunk (n=51); b. Raptor domináns expressziójú – a Rictor nem vagy alacsony expressziót mutatott és jellegzetes Raptor festődést detektáltunk (n=14); c. kiegyensúlyozott Rictor és Raptor expressziójú – hasonló intenzitású Rictor és Raptor IHC reakciók (n=38). Két esetben, ahol magas p-mTOR expresszió mellett az mTORC1 aktivitás markereinek pozitivitását nem tudtuk kimutatni (alacsony p-S6 és p-4EBP1 hiánya), mTORC2 komplexre jellemző Rictor dominancia volt megfigyelhető. Összefoglalva a magas mTOR aktivitású 76 esetből 39 Rictor dominánsnak (mTORC2), 8 Raptor dominánsnak (mTORC1), míg 29 eset kiegyensúlyozott mTORC1 és C2 komplex mennyiségűnek bizonyult (44. ábra).

Statisztikai módszerekkel az mTOR aktivitás és a két komplex mennyiségi különbségeit összehasonlítottuk a betegek klinikai jellemzőivel. A betegek neme, életkora, a daganatok Dukes stádiuma és az mTOR aktivitás között szignifikáns összefüggéseket nem tudtunk kimutatni. Az alacsony mTOR aktivitású betegek csoportjában az 5 éves túlélés 77,8% (overall survival = OVS), míg a magas mTOR aktivitásúak esetében ez szignifikánsan rosszabb, 46,1%

volt. A legjobb kezelési, túlélési eredményeket azokban az esetekben tapasztaltuk, ahol alacsony mTOR aktivitás mellett domináns Raptor expresszió, alacsony mTORC1 aktivitás volt megfigyelhető, minden beteg a diagnózis után a kezelést követően legalább 5 évet élt.

44. ábra Humán coloncarcinoma esetek mTOR aktivitás különbségei in situ. Az immunhisztokémiai festések különbségeit bemutató reprezentatív fotók (immunfestések Rictor, Raptor S6 és p-mTOR ellenanyagokkal, DAB-barna színreakció, hematoxilin háttérfestés-kék, nagyítás 20x), illetve az értékelés és összefüggései a betegek túlélésével. (overall survival - OVS)

A két rosszabb prognózisú csoportban – magas mTOR aktivitás + Rictor domináns expresszió, illetve magas mTOR aktivitás mellett komplex dominanciát nem mutató esetek – egymáshoz képest számottevő különbséget az 5 éves túlélési adatokban (5 éves OVS 41%, 48,3%) nem tudtunk kimutatni. A legrosszabb túlélési adatokat magas mTOR aktivitás mellett Rictort is nagy mennyiségben expresszáló eseteknél tapasztaltunk. Megvizsgáltuk a túlélési adatokat csak az mTOR komplexek mennyiségének függvényében is; a Rictor expresszió az mTOR aktivitástól függetlenül is összefüggést mutatott a betegség rossz prognózisával. A legprogresszívebb, legrövidebb túlélést mutató eseteket a tumorszövetben jellemző magas mTOR aktivitás és a kapcsolt magas Rictor expresszió jellemezte a Kaplan Meier görbék szerint. Cox regressziós analízis igazolta, hogy a magas mTOR aktivitás, a domináns Rictor expresszió független és a Dukes stádium meghatározáshoz képest erősebb rizikó faktor, mindkettő jelezheti a rossz prognózist. A magas mTOR aktivitás vagy Rictor expresszió más faktoroktól függetlenül emelte a rövidebb túlélés relatív kockázatát (magas mTOR aktivitás RR 2,62 (1,2-5,95) p=0,02; magas Rictor expresszió RR 2,518 (0,89-7,094) p=0,081) (45. ábra).

45. ábra. Különböző mTOR aktivitású colon carcinomás betegcsoport túlélési adatainak elemzése Kaplan-Meier görbékkel, illetve COX regresszió analízissel (relatív kockázat számítások eredményei)

A bemutatott in situ mTOR aktivitás különbségeknek jelentőségét in vitro rapalógok illetve második generációs mTOR gátlók és EGFR inhibitor kombinált kezelések EGFR inhibitor érzékenyítő hatásaival igazoltuk coloncarcinoma sejtvonalakban. Kísérleteinkben a gefitinib és a cetuximab nem gátolta a proliferációt, illetve nem indukált apoptózist csak nagyon magas dózisú kezelésekben (72 h). Western blot és Duolink immunfestés eredményeink a sejtvonalakban a biopsziás minták eredményeihez hasonló magas mTOR aktivitást igazoltak.

Az egyedi expressziókülönbségek összefüggést mutattak a 72 órás rapamycin kezelés és az mTORC1 és C2 komplexet is gátló PP242, valamint a duál mTOR inhibitor (NVP-BEZ235) kezelések hatásával. A Rictort nagy mennyiségben termelő sejtek (GC3, HCT116 és HT29) kevésbé érzékenyek a rapamycin kezelésre, míg az mTORC2 aktivitást nem mutató sejtek (alacsony Rictor expresszió) az mTORC1 és C2 komplexet is gátló, dual inhibitor kezelésekkel szemben is hasonló érzékenységgel rendelkeznek (46. ábra).

46. ábra Humán coloncarcinoma sejtvonalak mTOR aktivitásának jellegzetességei, illetve

EGFR és mTOR

inhibitor érzékenységük. A sejtvonalakat általánosan magas mTOR aktivitás és egy részükben igen jelentős mTORC2 komplex expresszió jellemzi (pl. a HCT116 és CaCo2 sejtek Duolink festéseiben mindkét sejtvonalban intenzív immunreakció figyelhető meg az mTOR és Rictor Duolink – mTORC2 festésben – zöld reakció) (a.); Gefitinib- és cetuximab-rezisztencia a különböző coloncarcinoma sejtekben, illetve a rapamycin kezelés érzékenyítő hatása is megfigyelhető a sejtvonalak többségében (b.) (* p<0,05).

Előbbieknek megfelelően az mTOR gátló rapamycin, illetve NVP-BEZ235 és az EGFR inhibitor érzékenyítő hatást tudtunk igazolni szinte valamennyi rezisztens sejtvonal esetében.

A ciszplatin + mTOR gátló kombinációk hatásait is igazoltuk in vitro három, eltérő rapalóg érzékenységű coloncarcinoma sejtvonalban (47. ábra). Utóbbi klinikai jelentőségére azóta számos példát ismerünk nemcsak coloncarcinomák, de egyes más adenocarcinomák, így tüdődaganatok esetében is.

47. ábra mTOR inhibitorok EGFR inhibitor és ciszplatin érzékenyítő hatásai colon carcinoma sejtvonalakban in vitro. Kiemelkedően magas mTORC2 komplex aktivitással

rendelkező humán

coloncarcinoma sejtvonalak esetében a rapamycin kevésbé, de a dual inhibitor kezelések szignifikánsan fokozták a gefitinib hatásait in vitro tenyészeteinkben (a.), Előbbiek mellett a ciszplatint érzékenyítő hatásokat is jellemeztük három, eltérő ciszplatin érzékenységű sejtvonal esetében. Ezek az eredmények jól mutatják, hogy az alacsonyabb dózisú ciszplatin kezelés is hatásossá tehető kombinált kezelésekben (b.)