Molekuláris virológiai vizsgálatok

A molekuláris virológiai vizsgálatok során olyan hazai izolátumokat választottunk, amelyek korábban a tesztnövény kísérletek és a DAS-ELISA vizsgálat során tobamovírusnak bizonyultak. Célunk volt, hogy a

0DJ\DURUV]iJRQ HOWpU LG EHQ pV KHO\HQ EHJ\ MW|WW L]ROiWXPRNDW

molekuláris módszerekkel is azonosítsuk, illetve egy magyar izolátum köpenyfehérjerészletének nukleotid sorrendjét meghatározzuk, valamint a

más országokban leírt PMMoV izolátumok szekvenciájával összehasonlítsuk.

3.3.1. Össz-nukleinsav kivonás és tisztítás

$NLYRQiVWMpJHQK W|WWN|UOPpnyek között végeztük. Két – az adott

L]ROiWXPPDO IHUW ]|WW - Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc Q|YpQ\U O

származó levélkorongot dörzsmozsárban, teljes nukleinsav kivonó pufferben feltártunk (White és Kaper 1989). Az extraktumot több

OpSFV EHQ IHQRO PDMG NORroform (1 térfogatnyi fenol + 1 térfogatnyi kloroform) hozzáadásával tisztítottuk meg a gazdanövény sejtalkotóitól és

IHKpUMpLW O$]|VV]-nukleinsavat abszolút alkohollal vontuk ki. Az etanolos

PRViVW N|YHW HQ D QXNOHLQVDYDW YiNXXPV]iUtWyEDQ V]iUtWRWWXNmajd steril desztillált vízben visszaoldottuk (White és Kaper 1989).

3.3.2. DNS másolat készítése reverz transzkripcióval

A tisztított és visszaoldott vírus RNS-hez 3’ indítószekvenciát (primert) adtunk, majd 65°C-on denaturáltuk. Ezután az oldathoz adtuk a reverz transzkriptáz enzimet (50 unit/reakció), annak pufferjét és a nukleotidokat, majd a reakcióelegyet 1 órára 42°C-ra tettük. Ily módon a vírus RNS-sel komplementer DNS másolatot (copy DNS, cDNS) hoztunk létre (Sambrook et al. 1989).

3.3.3. Polimeráz láncreakció (PCR)

A molekuláris biológiai vizsgálatokhoz olyan univerzális primerpárt

WHUYH]WQN DPL D OHJW|EE SDSULNiW IHUW ] WREDPRYtUXVW IHOLVPHUL $

tobamovírusok szekvenciáját az EMBL/Genbank adatbázisából vettük (internetcím: www.genome.ad.jp $ 0DJ\DURUV]iJRQ HO IRUGXOy

legfontosabb tobamovírusokat kiválogattuk az adatbankban található szekvenciák nagy száma miatt. Ezekben a szekvenciákban egy olyan

UpV]OHWHW NHUHVWQN DPL KR]]iYHW OHJ PHJHJ\H]LN OHJDOiEE D OHJIRQWRVDEE

tobamovírusok esetében, ide terveztük az univerzális primerpárt. Az 5’ végi

XQLYHU]iOLV SULPHU D &3 JpQ HO WW WDOiOKDWy GHJHQHUiOW YtUXVV]HQV] $ ¶

végi primer szintén degenerált, reverz komplementer, és a vírus 3’ nem-kódoló régiójának végén található.

A Magyarországon HO IRUGXOy OHJIRQWRVDEE WREDPRYtUXVRNUD

(TMV-U1, PMMoV, ObPV) specifikus primereket terveztünk. A primereket olyan szakaszra illesztettük, ahol az adott tobamovírus

V]HNYHQFLiMD MHOHQW VHQ HOWpU D W|EEL WREDPRYtUXVpWyO $] XQLYHU]iOLV ¶

végi primert használtuk a specifikus primerpárok 3’ végeként is. A ObPV

SULPHU D &3 JpQ HO WW PtJ D 709-U1 és PMMoV specifikus primerek a CP génen belül helyezkednek el. A specifikus primerek tervezésekor ügyeltünk arra, hogy a primerek által kiemelt szakaszok hossza jelenW VHQ

különbözzön egymástól, így azok multiplex PCR vizsgálatokhoz felhasználhatóak legyenek, vagyis a tobamovírusok azonosíthatóak legyenek a kapott PCR termék mérete alapján (2. ábra).

Univerzális primerpár:

PMMoV esetében: 699 bp TMV-U1 esetében: 709 bp ObPV esetében: 782 bp

Specifikus primerek:

PMMoV esetében: 613 bp

TMV-U1 esetében: 555 bp ObPV esetében: 899 bp

2. ábra. A primerek által felismert szakaszok hossza

A nukleotidok sorrendjének megállapításakor, a restrikciós

HQ]LPDQDOt]LVQpO pV D NHYHUW IHUW ]pVHV NtVpUOHWQpO D 300R9 VSHFLILNXV

CP1 (vírusszensz) és CP2 (reverz komplementer) primereket használtuk (Tenllado et al. 1994). Az univerzális tobamovírus és vírus-specifikus primereket a 3. ábra mutatja.

univerzális tobamovírus 5’ primer:

5’ - G(AT)CGC(GC)GA(GT)TC(GT)GATTCGT(AT)TTAAATATG – 3’

univerzális tobamovírus 3’ primer:

5’ – TGGGCC(GC)CTACC(GC)G(GC)GG – 3’

TMV-U1 primer:

5’ – GTCGTTCAAAGACAATTCAGTGAG – 3’

ObPV primer:

5’ – GGAGTTTCCAAACCTGTCGG – 3’

PMMoV primer:

5’ – CCATTAGAGTTACAAAAT(CT)TGTGTACTTC – 3’

CP1 primer:

5’ – CTGTGTACTTCGCGTTAGG – 3’

CP2 primer:

5’ – AATTCCTCAACATCGGGTCC – 3’

(a zárójelben tett bázisoknál a primer degenerált)

3. ábra. A PCR reakció során használt univerzális tobamovírus

és vírus-specifikus primerek (Tenllado et al. 1994 és Kálmán et al.

2001 alapján)

A PCR vizsgálat során a Fermentas cég termékeit használtuk. A reakció Perkin Elmer készülékben történt. A PCR reakcióelegy tartalmazta a cDNS-t, a felszaporítani kívánt szakasz kiemeléséhez szükséges 5’ és 3’

foszforilált indítószekvenciákat (primereket, 20 pM), a nukleotidkeveréket (10 mM), a MgCl2-ot (25 mM), D PHJIHOHO N|UOPpQ\HNHW EL]WRVtWy

puffert (10 × 3&5 SXIIHU pV D K VWDELOTaq polimeráz enzimet (2,5

XQLWUHDNFLy$3&5FLNOXVHOV OpSpVHNpQWD'16-t denaturáltuk 94°C-on 15 másodpercig, ezt követte a primerek kapcsolódása a templáthoz (anellálás) 50°C-on (a CP1-CP2 primerek esetében 61°C-on) 30 másodpercig, majd a lánchosszabbítás 72°C-on 2 percig. A ciklust 40-szer ismételtük.

3.3.4. Gélelektroforézis

A kapott PCR termékeket agaróz gélben (1,2 %), gélelektroforézissel

HOOHQ UL]WN P$ iUDPHU sségnél). Az elektroforézishez használt gél fluoreszcens festéket, etídium-EURPLGRW WDUWDOPD]RWW JPO $ V]NVpJHVViYRNDWDJpOE OV]LNpYHONLYiJWXNNLYRQyNLWVHJtWVpJpYHO%,2

-RAD Prep-A-Gene^TM DNA Purification Kit) tisztítottuk és desztillált vízben visszaoldottuk.

5HNRPELQiQVSOD]PLGRNHO iOOtWiVD

Az így kapott DNS szakaszt (inzertet) pGEM-T plazmidvektorba (Promega) építettük T4 DNS ligáz enzim segítségével (Sambrook et al.

1989).

3.3.6. A rekombináns plazmidok bejuttatása baktérium sejtekbe

A UHNRPELQiQV SOD]PLGRW K VRNNDO Escherichia coli DH5α plazmidmentes kompetens baktériumsejtekbe juttattuk. A módszer lépéseit Sambrook et al. (1989) szerint végeztük. A rekombináns plazmid és a

EDNWpULXPVHMWHNNHYHUpNpWHO V]|UMpJUHPDMG°C-RVYt]I UG EHpVLVPpW

jégre helyeztük. A baktérium szuszpenziót – ampicillin antibiotikumot tartalmazó - LB táptalajon egyenletesen eloszlattuk, és egy éjszakán át 37°C-on növesztettük. A táptalajon csak azok a baktériumok voltak képesek osztódni, amelyek hordozták az ampicillin rezisztenciagént. A

OHPH]HQ Q|Y EDNWpULXP NROyQLiNDW ~Q ³EOXH-white” szelekcióval

pUWpNHOWN $ NpN V]tQ EDNWpULXP NROyQLiN WDUWDOPD]WiN D SOD]PLGRW GH

ebben az esetben az inzert nem épült be. A fehér kolóniáknál egy, a plazmLGEDQ OpY HQ]LP -JDODNWR]LGi] P N|GpVppUW IHOHO V JpQ NLIHMH] GpVH D] LQ]HUW EHpSOpVH PLDWW JiWROW YROW tJ\ D NpN V]tQ QHP

alakulhatott ki. Ezért a további munkához a fehér baktérium telepeket használtuk fel (Sambrook et al. 1989).

3.3.7. A rekombináns plazmidok felszaporítása

A kiválasztott fehér telepeket folyékony (ampicillint tartalmazó) LB táptalajba oltottuk (Sambrook et al. 1989). A baktériumokat egy éjszakán át 37°C-on, folyamatos rázatás mellett növesztettük. A baktériumok mellett a beépült SOD]PLGRN LV IHOV]DSRURGWDN NOyQR]iV ,O\ PyGRQ HOHJHQG PHQQ\LVpJ '16-t kaptunk a szekvencia analízishez.

3.3.8. A plazmidok tisztítása

A baktériumkultúrát centrifugáltuk, így különítve el a baktériumsejteket a táptalajtól. A baktériumsejteket elpusztítottuk, a nemkívánatos sejttörmeléket és sejtalkotókat pedig eltávolítottuk. Végül a tisztított plazmidot abszolút alkohollal kivontuk, és szárítás után RNAse TE-ben visszaoldottuk. A tisztított rekombináns plazmidot

HOOHQ U]pVNpSSHQ EcoRI restrikciós endonukleázokkal emésztettük és gélelektroforézissel vizsgáltuk.

3.3.9. A nukleotid sorrend meghatározása

A felszaporított és tisztított DNS szakasz nukleotid sorrendjét a madridi Centro de Investigaciones Biológicas-ban (Biológiai Kutatások Központja) található szekvenáló berendezéssel határozták meg. A kapott adatokat a „Wisconsin Genetics Computer (GCG) Package Version 9.1”

számítógépes programcsomag segítségével értékeltük.

3.4. A paprika enyhe tarkulás vírus (Pepper mild mottle virus, PMMoV) izolátumok összehasonlító vizsgálata

3.4.1. Szekvencia analízis

A Japánban, Koreában, Olaszországban, Spanyolországban, Brazíliában és Taiwanban leírt PMMoV izolátumok szekvenciáját az EMBL/Genbank adatbázisból vettük át (5. táblázat). A magyar és a külföldi izolátumok szekvenciáját a "Wisconsin Genetics Computer (GCG) Package Version 9.1" számítógépes programcsomag, valamint a BLASTN 2.2.4.

program (Altschul et al. 1997) segítségével hasonlítottuk össze. Ezenfelül meghatároztuk a magyar PMMoV izolátumok elhelyezkedését a tobamovírusok filogenetikai törzsfájában. A filogenetikai törzsfát a Treecon programmal készítettük.

5. táblázat. A szekvencia adatbankban található külföldi PMMoV izolátumok

Az izolátum neve Az izolátum száma a szekvencia adatbankban

Az izolátum szekvenált része

Koreai izolátum, „P0” AF103776 CP gén Koreai izolátum, „P1” AF103777 CP gén Koreai izolátum, „P2” AF103778 CP gén

Koreai izolátum, „P” AB084456 CP gén, MP gén

Olasz izolátum, „PMMoV-I” X72587 CP gén + 3’nem-kódoló régió

Taiwani izolátum M87827 CP gén

Spanyol izolátum, „PMMoV-S” M81413 Teljes genom Spanyol izolátum, „Ia” AJ308228 Teljes genom Japán izolátum, „PMMoV-J” AB000709 Teljes genom Japán izolátum, „PMMoV-Ge1” AB062049 CP gén Japán izolátum, „PMMoV-Ge4” AB062050 CP gén Japán izolátum, „PMMoV-Ge5” AB062051 CP gén

Japán izolátum, „PMMoV-Oh” AB062052 CP gén Japán izolátum, „PMMoV-Tosa” AB062053 CP gén Japán izolátum, „PMMoV-Na” AB062054 CP gén Japán „C-1421”attenuált izolátum AB069853 Teljes genom

Brazil izolátum AF525080 CP gén

5HVWULNFLyVHQ]LPDQDOt]LVpVNHYHUWIHUW ]pVHVNtVpUOHW

A restrikciós enzim analízishez a magyar PMMoV izolátumok mellett két spanyol PMMoV izolátumot használtunk (6. táblázat), melyeket a madridi Centro de InvestigaciyQHV%LROyJLFDVLQWp]HWE O'U-RVp-Ramón Díaz-Ruíz bocsátott rendelkezésünkre.

6. táblázat. A munkánk során használt spanyol PMMoV-S izolátumok (Rodrígue-Cerezo et al. 1989 alapján)

Az izolátum neve $J\ MWpVKHO\H $J\ MWpV

ideje

Az izolátum gazdanövénye 174 (P78/84) Alméria, Spanyolország 1984 Capsicum annuum

(Bellamy) 219 (P132/85) Alméria, Spanyolország 1985 Capsicum annuum

(Clovis)

Nicotiana tabacum cv. Xanthi-ncQ|YpQ\HNHWIHUW ]WQNDVSDQ\RO

(174-es, 219-es) PMMoV-S izolátummal, illetve három, általunk kiválasztott, magyar PMMoV izolátummal (KD-2, KD-63, KD-68). A

IHUW ]|WW Q|YpQ\HNE O -8 db izolátumonként) 5 nap elteltével kivontuk a nukleinsavat és a CP1-CP2 primerpárral PCR vizsgálatot végeztünk. A PCR termékeket TaqI restrikciós enzimmel emésztettük (65°C-on kb. 90

percig). Az emésztett termékeket 6%-os poliakrilamid gélben futtattuk, majd futtatás után a gélt etídium-bromiddal (0,05 µl/ml) festettük.

.HYHUWIHUW ]pVHVNtVpUOHWHNHWYpJH]WQNDVSDQ\ROpVDPDJ\DU

izolátumokkal. L¹ rezLV]WHQFLDIRN~SDSULNiNDW'XOFH,WDOLDQRIHUW ]WQN

minden növényen a legalsó, kifejlett levélpárt. Egyes növényeket a 174-es és a 219-HVVSDQ\ROL]ROiWXPRNNDOIHUW ]WNPtJPiVRNDWDPDJ\DU.'-2 és KD-63-as izolátumokkal. A 10 JPONRQFHQWUációjú inokulumokból 5-5

O-t kevertünk össze (5 O-HV O-HVLOOHWYH O.'-2-HV O

KD-63-as), és ezzel a keverékkel inokuláltuk a leveleket (kezelésenként 2-2

Q|YpQ\W.RQWUROONpQWPLQGHQHJ\HVL]ROiWXPPDONO|QLVIHUW ]WQN-1 növényt (5 OD]adott inokulumból + 5 O1D-foszfát oldat). Nyolc nappal a

IHUW ]pVXWiQDQHPLQRNXOiOWV]LV]WHPLNXVIHUW ]pV OHYHOHNE OQXNOHLQVDY

kivonás után a CP1-CP2 primerpárral PCR vizsgálatot végeztünk. A PCR termékeket Taq I restrikciós enzimmel emésztettük és kapott fragmenteket 6 %-os poliakrilamid gélben futtattuk. Futtatás után a gélt etídium-bromidot

OPOWDUWDOPD]ó oldatba tettük 5-10 percre, majd festés után az eredményeket értékeltük.

3.5. A paprika enyhe tarkulás vírus (Pepper mild mottle virus, PMMoV)

In document Paprika enyhe tarkulás vírus (Pepper mild mottle virus, PMMoV) izolátumok patológiai, szerológiai és molekuláris biológiai jellemzése (Pldal 64-73)