2.3.6. A tobamovírusok terjedése
2.3.7.2. Biotechnológiai módszerek a tobamovírusok elleni védekezésben
A biotechnológiai eljárások során a növényi genomba új gén(eke)t
MXWWDWQDN EH UH]LV]WHQV IDMWiN HO iOOtWiVD FpOMiEyO $ EHMXWWDWiV W|UWpQKHW
szomatikus hibridizációval, vagy molekuláris genetikai módszerekkel
WUDQV]IRUPiOiV NO|QE|] YHNWRURN DONDOPD]iViYDO LQGLUHNW PyGV]HU;
vagy direkt transzformáció, melynek során a DNS passzívan jut be, pl.
génpuska segítségével).
$ WUDQV]JpQLNXV Q|YpQ\HN HO iOOtWiViYDO W|UWpQ YtUXVRN HOOHni védekezést a bevitt gének forrása alapján csoportosíthatjuk:
a. 9tUXVHUHGHW JpQHN
b. 1|YpQ\LHUHGHW WHUPpV]HWHVYtUXVHOOHQiOOyViJJpQHN
c. Egyéb vírusellenállóság gének
A kórokozótól származtatott rezisztencia
(OPpOHWLOHJ EiUPHO\ YtUXV HUHGHW V]HNYHncia alkalmas arra, hogy
YDODPLO\HQ V]LQW HOOHQiOOyViJRW YiOWVRQ NL D WUDQV]JpQLNXV Q|YpQ\EHQ
(Lomonossoff 1995). A legtöbb kísérletet a CP gén, a replikáz gén, a MP gén, a szatellit RNS-ek és a defektív interferáló RNS-ek beépítésével végezték (Fauquet és Beachy 1992, Stiekema et al. 1993, Wassenegger 1998). A tobamovírusok elleni védekezésben eddig a CP génnel és a
UHSOLNi] JpQQHO WUDQV]IRUPiOW Q|YpQ\HNQpO VLNHUOW MHOHQW VHEE
eredményeket elérni.
A köpenyfehérje génnel indukált vírusrezisztencia
E rezisztenciaforma felismerését a keresztvédettség felfedezése tette
OHKHW Yp McKinney 1929). Egyes kutatók feltételezték, hogy a keresztvédettség során a második vírustörzzsel szembeni rezisztencia annak
N|V]|QKHW KRJ\ D VHMWHNEHQ PiU MHOHQ YDQ D] HOV Yírustörzs köpenyfehérjéje. Az 1980-as években géntranszformációval olyan
Q|YpQ\HNHW iOOtWRWWDN HO PHO\HN D YtUXV &3 JpQMpW PHJIHOHO SURPRWHU
mögött hordozták, így a növények saját maguk termelték a vírus CP-jét.
Beachy et al. (1985), valamint Powell et al. (1986) a TMV CP-jével dohánynövényeket transzformáltak. A felnevelt növények köpenyfehérjét
WHUPHOWHNpVQDJ\IRN~UH]LV]WHQFLiWPXWDWWDND709IHUW ]pVpYHOV]HPEHQ 0D PiU W|EE PLQW V]i] LO\HQ PyGRQ HO iOOtWRWW YtUXVUH]LV]WHQV
növény létezik, ezek ellenállóak az adott vírussal, és bizonyos mértékig a rokon vírusokkal szemben (Fauquet és Beachy 1992, Stiekema et al. 1993, Tepfer és Balázs 1997, Miller és Hemenway 1998, Wassenegger 1998). A PMMoV CP-jével transzformált növényeken például késleltetve, vagy
HJ\iOWDOiQ QHP IHMO GWHN WQHWHN D 300R9 IHUW ]pVpUH .pV EE DODNXOWDN
ki a tünetek abban az esetben is, ha a TMV egyik közönséges törzsével
IHUW ]WpNDQ|YpQ\HNHWLim et al. 1997). Általában az F1 nemzedékben és
D] D]W N|YHW JHQHUiFLyNEDQ pUWpNHOLN Drezisztenciát, ami vizuálisan is
PHJQ\LOYiQXOD]LQRNXOiOWOHYHOHNHQNHYHVHEEDIHUW ]pVLKHO\HNV]iPDpV
a szisztemikus tünetek is csökkennek, a vírus kisebb mennyiségben
DNNXPXOiOyGLN D IHUW ]pV XWiQ $] LQRNXOXP NRQFHQWUiFLyMiQDN Q|YHOpVH
megszüntetheti a rezisztenciát, pl. a TMV esetében.
A köpenyfehérje génnel indukált rezisztencia mechanizmusát kiterjedten kutatták (cf. Szilassy et al. 1999). A nem teljes köpenyfehérjék több esetben nem közvetítettek ellenállóságot, ami arra utalt, hogy esetleg magD D IHKpUMH D IHOHO V D] HOOHQiOOyViJpUW (]HNQHN D] DGDWRNQDN
ellentmondanak azok a kísérletek, melyek során a köpenyfehérje gén
antiszensz orientációban beültetve is védelmet nyújtott néhány esetben. Egy másik elképzelés szerint a köpenyfehérje által közvetített rezisztencia
HVHWpQDIHUW ]|WWVHMWHNEHQDYLULRQRNV]pWYiOiVDJiWOyGLNDNL]iUyODJFVDN
nukleinsavat tartalmazó inokulum ezért töri át a rezisztenciát. Ezzel szemben a PVX RNS-pYHO W|UWpQ LQRNXOiOiV QHP V]QWHWWH PHJ D
transzgénikus növények rezisztenciáját. A rezisztencia mechanizmusát
PDJ\DUi]yHONpS]HOpVHNN|]OOHJYDOyV]tQ EEQHNDN|YHWNH] NW QQHN
1. A vírus nem tud megválni fehérjeburkától, vagy a transzgén által
NyGROW &3 EORNNROMD D Q|YpQ\L VHMWEHQ PHJOpY UHFHSWRURNDW
melyekhez a vírus DIHUW ]pVVRUiQN|W GLN
2. A CP-MpW O PHJV]DEDGXOW QXNOHLQVDY D WUDQV]JpQLNXV Q|YpQ\EHQ WHUPHO G|WW N|SHQ\IHKpUMpYHO ~MUD EHEXUNROyGLN H]iOWDO QHP WXG IHUW ]QL
3. A CP a vírus RNS replikációját befolyásolja.
4. $ &3 D] 03 IHOKDOPR]yGiViUD pV P N|GpVpUH KDW tgy befolyásolja a rezisztenciát (Bendahmane et al. 2002).
A replikáz génnel indukált vírusrezisztencia
Golemboski et al. (1990) a TMV replikáz fehérjéjét expresszálták növényekben, aminek következtében a növények ellenállóak lettek a
YtUXVIHUW ]pVVHO V]Hmben. A jelenség mechanizmusáról keveset tudunk,
W|EEHVHWEHQQLQFVNDSFVRODWDIHKpUMHNLIHMH] GpVHpVDUH]LV]WHQFLDN|]|WW
$] tJ\ NLDODNtWRWW UH]LV]WHQFLD V] N YpGHWWVpJHW HUHGPpQ\H] FVXSiQ D
legközelebbi rokon vírustörzsek ellen hatékony.
Tenllado et al. (1995) olyan klónt készítettek (P54-5), amely a PMMoV-S 54 kDa fehérjét kódoló régióját – vagyis a replikáz gén egy szakaszát - tartalmazta. A klónnal transzformált Nicotiana benthamiana
növények közül hat, egymástól független vonalat vizsgáltak. A transzgénikus növényeket PMMoV-S-VHO IHUW ]YH NpWIpOH UH]LV]WHQFLDYiODV]W WDSDV]WDOWDN $] HOV WtSXV~ HJ\ WHOMHV PDJDVIRN~
UH]LV]WHQFLD YROW H]HVHWEHQ QHP IHMO GWHN WQHWHN GH NLVPpUWpN
replikációt meg lehetett figyelni. Csupán két vonal néhány egyede mutatta ezt a rezisztenciatípust. A második rezisztenciatípus késleltetett, indukált, de szintén magasfokú rezisztenciának bizonyult. Az ebbe a csoportba
WDUWR]y Q|YpQ\HN NH]GHWEHQ IRJpNRQ\DN YROWDN GH NpV EE ÄNLJ\yJ\XOWDN´
D V]LV]WHPLNXV IHUW ]pVE O $ Äkigyógyult”, tünetmentes levelek rezisztenseknek bizonyultak a PMMoV-S-nek és egy rokon vírusának (de nem a TMV-QHN IHUW ]pVpYHO V]HPEHQ $ WUDQV]IRUPiOW Q|YpQ\HN D
PMMoV-, IHUW ]pVpUH XJ\DQFVDN NpWIpOH YiODV]W DGWDN D 3D009 pV D
TMV-8 IHUW ]pVpYHO V]HPben pedig fogékonynak bizonyultak. Mindkét rezisztenciatípus hasonlított a replikáz-által közvetített rezisztenciára. A replikáz-iOWDON|]YHWtWHWWUH]LV]WHQFLDMHOOHP] MHKRJ\DUH]LV]WHQFLiUDQHP
hat az inokulum dózisa; a homológ vagy közeli rokon vírusokra korlátozódik; nincs összefüggés a rezisztencia szintje és a transzgén
NLIHMH] GpVpQHN V]LQWMH N|]|WW $] (/,6$ (P]\PH /LQNHG ,PPXQR
Sorbent Assay) vizsgálatok szerint a komplett rezisztenciájú növényeknél végig nagyon alacsony volt a CP szintje. A késleltetett rezisztenciatípust
PXWDWy Q|YpQ\HNQpO HO V]|U PDJDV YROW D &3 V]LQWMH PDMG QDSSDO D IHUW ]pV XWiQ GUDV]WLNXVDQ OHFV|NNHQW D] ~M WQHWPHQWHV OHYHOHNEHQ $]
RNS szintje hasonlóan alakult. A késleltetett rezisztenciájú növényt 35
QDSSDO DIHUW ]pVXWiQ ~MUD IHUW ]WpN 300R9-S-VHO ~M WQHW QHP IHMO G|WW
és a CP szintje sem emelkedett. Ugyanakkor TMV-U1-HO IHUW ]YH
kialakultak az U1-UH MHOOHP] WQHWHN DPL DUUD XWDOW KRJ\ D NLDODNXOW
rezisztencia rendkívül vírus-specifikus. A késleltetett rezisztencia nem függött össze a növények fejlettségével, korával. Ehhez hasonló késleltetett
rezisztenciát – más kutatócsoportok - D V]LOYDKLPO YtUXVQiO Plum pox virus, PPV) és a TEV-nél is megfigyeltek.
Tenllado et al. (1996) tovább kutatva a replikáz által közvetített rezisztenciát egy olyan klónt készítettek (P54-7), amely nem a teljes 54 kDa gént tartalmazta. Ez a módosított, „csonka” gén egy kb. 18 kDa-os fehérjét kódolt. A teljes génnel transzformált növények közt akadt olyan, amely kezdetben fogékony vROW GH NpV EE UH]LV]WHQVVp YiOW D FVRQND JpQQHO WUDQV]IRUPiOWDN N|]W D]RQEDQ LO\HQ QHP IRUGXOW HO $ KDW FVRQND
génnel transzformált vonal közül 4 nem mutatott rezisztenciát a PMMoV-S
IHUW ]pVpYHO V]HPEHQ GH WQHWHNHW pV YtUXV &3-W PXWDWWDN NL D IHOV
szisztemikus levelekben. Két vonalból néhány egyed teljes rezisztenciát
PXWDWRWW QHP IHMO GWHN WQHWHN pV D] (/,6$ YL]VJiODW LV NHYpV &3-t mutatott ki, vagy egyáltalán nem mutatott. Ezen vonalakból azonban a legtöbb növény fogékony volt, de csak 3-5 nap múlva jelentek meg a tünetek (néhány egyed pedig egészen a 21. napig nem mutatott tüneteket).
A 61-es vonal esetén, akár komplett, akár késleltetett rezisztenciát mutattak a növények, a CP felhalmozódása csökkent volt az inokulált levelekben a kontrollhoz képest.
Protoplaszttal végzett tanulmányok alapján feltételezték, hogy az 54 kDa-os fehérje lehet az aktív molekula a replikáció által közvetített rezisztenciában, azonban kimutatni nem tudták a TMV-vel és a PMMoV-S-el transzformált növényekben. Nem volt összefüggés a transzkriptumok
PHQQ\LVpJHpVDUH]LV]WHQFLDN|]WVHPDWHOMHVVHPDFVRQNDJpQWNLIHMH]
Q|YpQ\HNQpO 0LQGNpW HVHWEHQ XJ\DQRO\DQ PpUHW WUDQV]NULSWXPRN
jelenlétét mutatták ki, azonban a csonka gént tartalmazókban kisebb mértékben. A csonka JpQQHO WUDQV]IRUPiOW Q|YpQ\HN D IHUW ]pV XWiQ QDSLJPXWDWWiNDNpVOHOWHWHWWUH]LV]WHQFLiW$IHMO G|WWV]LV]WHPLNXVWQHWHN
(mozaik, fodrosodás) eltértek a kontrollnál (a teljes, 54 kDa gént tartalmazó
WUDQV]IRUPiOW Q|YpQ\HNQpO IHMO G|WW WQHWHNW O VDtnyulás,
Q|YHNHGpVJiWOiV $ YtUXVNRQFHQWUiFLyMD QDSSDOD IHUW ]pV XWiQLVD QDSQiO PpUW pUWpNHW PXWDWWD +D QDSSDO D IHUW ]pV XWiQ D PHJYiOWR]RWW
IHQRWtSXV~ Q|YpQ\ V]|YHWQHGYpYHO GRKiQ\RNDW IHUW ]WHN D 300R9-S-re
MHOOHP] WQHWHNHW NDSWDN $] 4 kDa mRNS szintje végig nem változott,
H]pUWH]QHPOHKHWHWWIHOHO V$300R9-,IHUW ]pVpUHLVKDVRQOyHUHGPpQ\W
kaptak a csonka génnel transzformált növényekben, a PaMMV és TMV-U1-HO IHUW ]pVpUH SHGLJ IRJpNRQ\DN YROWDN $ 709-U1-el inokulált növények sem D NpVOHOWHWHWW WQHWIHMO GpVW VHP D PHJYiOWR]RWW WQHWWtSXVW
nem mutatták. Az eredmények szerint a komplett rezisztencia – ami mind a teljes, mind a csonka génnel transzformált növényekben megvalósul - magasfokú vírus-VSHFLILNXVViJRW PXWDW 9DOyV]tQ QHN W QLN KRJ\ D
komplett rezisztencia mindkét esetben (teljes és csonka gén) kizárólag vagy
I NpQW D WUDQV]JpQ 516 SURGXNWXPDL iOWDO N|]YHWtWHWW $ FVRQND JpQQHO
transzformált növények azonban sosem regenerálódtak úgy, mint a teljes génnel transzformáltak, amelyek kezdeti fogékonyság után „gyógyultak ki”. E növények megváltozott tünetegyüttest mutattak, ami csökkent patogenitással járt együtt.
Tenllado és Díaz-Ruíz (1999) a transzgén dózisa és a transzgénikus növények által kifejezett rezisztencia típusa (Tenllado et al. 1995) közti kapcsolatot is vizsgálták. Kísérletekkel támasztották alá, hogy a teljes rezisztencia összefügg a transzgén homozigóta állapotával, noha nem mindegyik homozigóta növény mutatott teljes rezisztenciát. A transzgén homozigóta állapRWD WHKiW V]NVpJHV YROW GH QHP HOHJHQG D 300R9
elleni rezisztencia biztosításához. A heterozigóták mindig késleltetett és
VRKDVHP WHOMHV UH]LV]WHQFLiW PXWDWWDN ÒJ\ W QLN NpW GRPLQiQV DOOpO
jelenléte szükséges a teljes rezisztencia megszilárdulásához, egy allél a
NpVOHOWHWHWW UH]LV]WHQFLiKR] HOHJHQG (] D]W MHOHQWL KRJ\ D JpQ-dózis
faktorként játszik szerepet ebben a típusú rezisztenciában, vagyis minél több a transzgén alléljeinek száma, annál magasabb a megvalósuló rezisztencia foka. Ez a tulajdonság – hogy a gén-dózis faktorként játszik szerepet – nagyon emlékeztet a „géncsendesítés” (gene silencing, GS) által biztosított vírusrezisztenciára (Goodwin et al. 1996).
6]iPRV RO\DQ HVHW LVPHUW D] LURGDORPEDQ DPLNRU D JpQNLIHMH] GpV
blokkolt a transzgénikus növényekben (Jorgensen 1992, Flavell 1994, Baulcombe és English 1996, Wassenegger és Pélissier 1998). Néhány esetben a transzgén elnyomja azokat a transzgén-, és homológ gén szekvenciákat is, melyek már korábban jelen voltak a növényben. Ezt a jelenséget együttes elnyomásnak (co-supression) nevezik (Hart et al. 1992, Dorlhac de Borne et al. 1994, De Carvalho et al. (O IRUGXO RO\DQ HVHWLVDPLNRU*6MHOHQLNPHJD]HJ\HWOHQWUDQV]JpQOyNXVV]DOUHQGHONH]
növényben (Hobbs et al. 1993). A GS megvalósulhat transzkripciós szinten
D JpQ NLIHMH] GpVpQHN EORNNROiVD UpYpQ Matzke et al. 1994, Neuhuber et al. 1994). Más vélemények szerint azonban az elnyomott gén átíródik, és a GS poszttranszkripcionálisan valósul meg az állandó mRNS szint csökkenés során (De Carvalho et al. 1992, Dehio és Schell 1994).
Újabban egyes kutatók olyan RNS alapú mechanizmust feltételeztek, ami a transzkripcionális és poszttranszkripcionális GS-pUW LV IHOHO V OHKHW
(Wassenegger és Pélissier 1998). A GS sokkal gyakrabban jelentkezik, ha a
Q|YpQ\EHQ D WUDQV]JpQ W|EE SpOGiQ\D LV HO IRUGXO YDJ\ D Q|YpQ\ D
transzgénre nézve homozigótává válik (De Carvalho et al. 1992, Hart et al.
1992, Dehio és Schell 1pKiQ\ HVHWEHQ D *6 |U|N|OKHW QHN
bizonyult (Meyer et al. 1993, Guo et al. 1998), máskor a meiózisnál visszafordítható volt (De Carvalho et al. 1992, Dehio és Schell 1994, Dorlhac de Borne et al. (J\HV V]HU] N V]HULQW YtUXV 516
V]iOVSHFLILNXV WtSXV~ *6 IHOHO V D 709-U1 elleni, 54 K régió által közvetített rezisztenciáért (Carr és Zaitlin 1991, Golemboski et al. 1993).
Tenllado és Díaz-Ruíz (1999) kimutatták, hogy a PMMoV 54 kDa transzgén „csendesített” volt a 12-es vonal F2 homozigóta növényeiben, mind a komplett, mind a késleltetett rezisztencia esetén. Amíg a kezdeti fogékonyságot mutató transzgénikus növényekben a 54 kDa transzkriptum magas szinten halmozódott fel, addig a homozigóta, teljes rezisztenciájú növények nem detektálható szinten tartalmazták az 54 kDa mRNS-t, habár a transzgén pontosan átíródott. A transzgén transzkriptumának elnyomása
SRV]WWUDQV]NULSFLRQiOLV IRO\DPDWRN HUHGPpQ\H )HOWpWHOH]KHW KRJ\
mindkét rezisztenciatípus és a transzgén poszttranszkripcionális csendesítése ugyanazon mechanizmus következménye, miként azt más
V]HU] NLVHPOtWHWWpNBaulcombe 1996, Goodwin et al. 1996, Wassenegger és Pélissier 1998).
Több elmélet látott napvilágot a poszttranszkripcionális GS
PDJ\DUi]DWiUDHJ\HVV]HU] NV]HULQWD]DQWLV]HQV]516HOQ\RPKDWMDDFpO
gén felhalmozódását (Grierson et al. 1991, Marano és Baulcombe 1998);
mások szerint kölcsönhatás és párosodás léphet fel a transzgén homológ kópiái között (Jorgensen 1992, Baulcombe és English 1996). Megint más
NXWDWyN D ÄNLIHMH] GpVL NV]|EpUWpN´ PRGHOOHO PDJ\DUi]]iN D MHOHQVpJHW
(Dehio és Schell 1994). Ez a modell azon az elven alapszik, hogy a géndózis növelése a transzgénikus sejtekben a transzkripció arányát (így a transzkriptum mennyiségét) növeli egészen addig a küszöbértékig, ami a vírusrezisztencia kiváltásához szükséges.
A PMMoV-S 54 kDa génjével transzformált, komplett rezisztenciájú
Q|YpQ\HNEHQ D *6 PiU D IHUW ]pV HO WW NLDODNXOW D Q|YpQ\HN LPPXQLVDN YROWDN $ NpVOHOWHWHWW UH]LV]WHQFLiM~ Q|YpQ\HNEHQ D *6 FVDN D IHUW ]pV
VWDELOL]iOyGiVD XWiQ DNWLYiOyGRWW $ Q|YpQ\HN IHMO GpVpYHO D WUDQV]JpQ
„csendesítése” is fokozódott (Dehio és Schell 1994).
9pGHNH]pVQ|YpQ\LHUHGHW UH]LV]WHQFLDJpQHNEHpStWpVpYHO
A Nicotiana glutinosa-ból származó N gén a TMV-vel szemben biztosít rezisztenciát (Dinesh-Kumar et al. 1995). Ezt a gént bejuttatták Nicotiana tabacum cv. Xanthi dohányokba és paradicsom növényekbe is (Whitham et al. $] tJ\ HO iOOtWRWW Q|YpQ\HNHQ D WREDPRYtUXVRN W|EEVpJpQHN IHUW ]pVpUH ORNiOLV Op]LyN MHOHQWHN PHJ V]LV]WHPLNXV WQHWHN QHPIHMO GWHN
Egyéb rezisztenciagének
Egyéb rezisztenciagének növénybe juttatásával is több alkalommal
VLNHUOW EL]RQ\RV PpUWpN YpGHWWVpJHW HOpUQL ËJ\ SO NtVpUOHWHNHW IRO\WDWWDN
ribozimokat kódoló gének, antitesteket kódoló gének, antiszensz vírusszekvenciák, „öngyilkos gének”, riboszóma–inaktiváló fehérjék,
YDODPLQW PDJDVDEE UHQG állatok génjeinek transzformálásával. A nem növénykórokozó mikroorganizmusok génjeivel indukált rezisztencia esetében a tobamovírusok elleni védekezésben is születtek eredmények. A Schizosaccharomyces pombae gombafajból klónozták a pac1 gént, mely a
NHWW sszálú RNS molekulát bontani képes RNázt kódolja. Ezt a gént
GRKiQ\Q|YpQ\HNEH MXWWDWYD D]RN UH]LV]WHQVVp YiOWDN D 7R09 IHUW ]pVpYHO
szemben (Iino et al. 1991, Watanabe et al. 1995). A jelenség elméleti
KiWWHUH IHOWHKHW HQ D] KRJ\ D] HJ\V]iO~ 516 YtUXVRN Ueplikációja során
NHWW VV]iO~ UHSOLNiFLyV LQWHUPHGLHUHN LV NHOHWNH]QHN pV D] 51i]
YDOyV]tQ OHJH]HNHWERQWMD