Molekuláris genetikai vizsgálatok eredményei

A 2013. évben beállított tenyészedényes kísérlet alatt begyűjtött minták RT-qPCR-el elvégzett génexpressziós vizsgálata során jelentős különbségeket találtunk a burgonya genotípusok nitrogén kezelésekre adott válasza között. A vizsgálatba bevont gének expressziójának értékét kettes alapú logaritmusra átszámolva adtuk meg, oszlop és vonal diagramokon ábrázolva. A NR-t (nitrát reduktázt) kódoló gén expressziós mintázatát a 33. ábra, míg a NiR-t (nitrit reduktázt) kódoló génét a 34. ábra, az AMT-t (ammónium transzportert) kódoló génét a 35. ábra, az AS-t (aszparagin szintetázt) kódoló génét pedig a 36. ábra mutatja be.

A delta-delta Ct módszer alkalmazása lehetővé tette, hogy az adatok értékelésekor ne csak a nitrogén kezeléseket, hanem a különböző genotípusok expresszióját is össze tudjuk hasonlítani. Mindegyik gén vizsgálatakor a White Lady 0.

kezelési napon gyűjtött mintáját vettük kontrollnak, ennek a kettes alapú logaritmusra átszámolt értéke 0. Ehhez képest a pozitív tartományban lévő értékek túlexpresszálódást jelentenek, a negatív tartományban lévők pedig a gén alulexpresszálódását jelzik.

Az adatsor tartalmaz két olyan pontot, ahol többszöri ismétlés után sem tudtunk expressziót kimutatni a vizsgálatok során. Ezek az S440 genotípus N3,00 kezelésében a 42. kezelési napon az AMT és AS gének expressziós értékei. Mivel a másik két gén kifejeződött a mintából, nagy valószínűséggel nem az RNS tisztítás vagy a minta előkészítés során történt esetleges hiba okozta az expresszió hiányát. Valószínűbbnek tartjuk, hogy az expresszió értéke a reakció detektálási küszöbe alatt maradt, ezért nem kaptunk eredményt.

A nitrát reduktáz a N asszimiláció első enzime, amely a nitrát nitritté redukálását katalizálja. Jelenlegi ismereteink szerint a nitrát reduktáz gén működését számos endogén és környezeti tényező befolyásolja, úgymint a nitrát, a fény, a cukrok és a víz (Meyer and Stitt, 2001).

84

33. ábra: A vizsgált burgonya genotípusok NR (nitrát reduktáz) génjének expressziója a nitrogén kezelések időtartama alatt (RT-qPCR-el vizsgálva delta-delta CT módszerrel, kontroll: White Lady

0 kezelési nap, háztartási gén: citokóm oxidáz, n=3) N7,50 N3,00 és N0,75: nitrogén kezelések

* szig. különbség N7,50-től az adott időpontban, t-próba P<0,05

85

34. ábra: A vizsgált burgonya genotípusok NiR (nitrit reduktáz) génjének expressziója a nitrogén kezelések időtartama alatt (RT-qPCR-el vizsgálva delta-delta CT módszerrel, kontroll: White Lady 0 kezelési nap, háztartási gén: citokóm oxidáz, n=3) N7,50 N3,00 és N0,75: nitrogén kezelések,

* szig. különbség N7,50-től az adott időpontban, t-próba P<0,05

*

86

35. ábra: A vizsgált burgonya genotípusok AMT (ammonium transzporter) génjének expressziója a nitrogén kezelések időtartama alatt (RT-qPCR-el vizsgálva delta-delta CT módszerrel, kontroll:

White Lady 0 kezelési nap, háztartási gén: citokóm oxidáz, n=3)

N7,50 N3,00 és N0,75: nitrogén kezelések, * szig. különbség N7,50-től az adott időpontban, t-próba P<0,05

* *

87

36. ábra: A vizsgált burgonya genotípusok AS (aszparagin szintetáz) génjének expressziója a nitrogén kezelések időtartama alatt (RT-qPCR-el vizsgálva delta-delta CT módszerrel, kontroll:

White Lady 0 kezelési nap, háztartási gén: citokóm oxidáz, n=3)

N7,50 N3,00 és N0,75: nitrogén kezelések, * szig. különbség N7,50-től az adott időpontban, t-próba P<0,05 -12

88

A qPCR vizsgálataink során a burgonya genotípusok eltérő NR expressziós mintázatot adtak. A White Lady fajta a NR-t kódoló génjének expressziója a kezelés előtti értékhez képest (0. kezelési nap) a 7. kezelési napon az N7,50 és N3,00 kezelésekben lényegesen alul expresszálódott, míg az N0,75 kezelésben nem változott.

A 14. kezelési napon az N7,50 és N3,00 kezelésekben a génkifejeződés mértékében növekedés történt, ezzel szemben az N0,75 kezelésben az expresszió szintje jelentősen lecsökkent és ezen az alacsony értéken maradt a kísérlet végig. A KN28 időponttól a N7,50 kezelésben a gén kifejeződése szintje tovább növekedett, míg a N3,00 kezelésben csökkenni kezdett. Az N3,00 és N0,75 N ellátottsági szinteken a kísérlet végén az N7,50 kezeléstől szignifikánsan alacsonyabb értéket kaptunk.

Az S440 genotípusnál a NR-t kódoló gén kifejeződésében a kiindulási állapothoz képest (KN0) KN7 időpontban mindegyik kezelésben felül expresszálódást figyeltünk meg. A 14. kezelési napon mért expressziós szint az előző időponthoz képest mindegyik N kezelésben csökkent. A 28. kezelési napon az N7,50 és N0,75 kezelésekben nőtt a gén expressziós szintje, míg az N3,00 kezelésben tovább csökkent.

A 42. kezelési napra a gén kifejeződés szintje mindhárom kezelésben közel azonos értéket mutatott, szignifikáns különbséget nem tudtunk kimutatni. A vizsgálat időtartama alatt az S440 genotípus expressziós értékeiben egyfajta fluktuáció ugyan megfigyelhető a NR-t kódoló gén expressziójában, de gén kifejeződési szintje a vizsgálat alatt végig a kiindulási érték közelében mozgott, lényegesen nem tért el attól.

A Katica fajtában a NR-t kódoló gén expressziója a 0. kezelési naphoz képest a 7. kezelési napon mindhárom kezelésben emelkedő (a N0,75-ben kiugróan emelkedő) szintet mutatott, majd a kezelés 14. napjára újra, a kiindulásival megegyező értékre csökkent. A három kezelésben mért érték a kísérlet végéig együtt változott, KN42 időpontban az N0,75-ben magasabb értéket kaptunk, mint az N7,50 és N3,00-ban. Az N3,00 és N0,75 kezelések expressziós rátájának N7,50-től való eltérése a kísérlet folyamán minden méréskor szignifikáns volt.

A Chipke fajta expressziója a 0. kezelési naphoz képest a 7. napon minden N kezelésben csökkent. Az N3,00 és N0,75 kezelésben nagyobb mértékben mint az N7,50-ben. Ehhez hasonló reakciót figyeltek meg Li és mtsai (2010) ’Shepody’ és

’Russet Norkotah’ fajtákon, akik tápoldat kultúrás kísérletben a 3. és 7. kezelési napon szintén az NR alul expresszióját tapasztalták az alacsonyabb nitrát ellátású növényeken.

A 14. kezelési napon az előzőhöz képest a gén felül expresszálódását tapasztaltunk, majd a 28. kezelési napon minden kezelésben a gén kifejeződés szintje visszatér a

89

kiindulási érték közelébe. Az utolsó, 42. napon újra növekedést tapasztaltunk az előző időponthoz képest, az N3,00-ban mértük a legmagasabb értéket.

A Hópehely NR expressziós görbéi nagyon hasonlóak az S440 genotípusnál kapottakhoz. A kezdeti növekedés után csökkenés, majd újra növekedés következett be az expresszióban, a kísérlet végére mindhárom N kezelésben visszatért a kiindulási érték közelébe, de a N3,00 és N0,75 kezelések eredményei minden méréskor statisztikailag különböztek N7,50-től.

A nitrit reduktáz gén a N asszimiláció második, a nitrát reduktáz utáni következő lépését, a nitrit ammóniává redukálását katalizáló enzimet kódolja. Emiatt nem meglepő, hogy az expressziós mintázatok, a görbék lefutása a nitrát reduktáznál tapasztalthoz hasonló. NR és NiR gének egy időben történő vizsgálatakor Li és mtsai is (2010) hasonló expressziós eredményeket kaptak a két génnél ’Shepody’, ’Red Pontiac’

és ’Russet Norkotah’ fajtákon.

A White Lady, S440, Hópehely és Chipke fajtán is megfigyeltük, hogy a N7,50 és N3,00 kezelés eredményei együtt mozogtak, vagy csak kis különbségeket mutattak a kísérlet időtartama alatt végig, ezzel szemben a N0,75 kezelés eredménye már a 7. (14.) kezelési napon elkülönült, a kísérlet 42. napjára pedig jelentősen alul expresszálódott a másik kettő kezelésben kapott értékhez képest. Ennek megfelelően szignifikáns különbségeket is a legtöbb esetben az N7,50 és N0,75 kezelések között tudunk kimutatni, N7,50 és N3,00 között csak néhány alkalommal az egész mérés alatt.

A NR expressziójához hasonlóan a NiR-nél is a Katicánál találtuk a legnagyobb mértékű eltérést a kiindulási értéktől, mindkét génnél felül expresszálódásról van szó.

Az N0,75 kezelésben a NiR lefutási görbéje nagyon hasonló a NR-nél tapasztalthoz, de az N7,50 és N3,00 kezelésekben az expressziós érték csúcsa időben eltolódva jelentkezett.

A növények az AMT gének által kódolt ammónium transzporterekkel közvetlenül a környezetből képesek ammónium iont felvenni. Kísérleteink során jelentős különbségeket találtunk az AMT gén expressziójában, habár a N kezelések különböző nitrát kocentrációk voltak, az irodalmi adatokból ismerjük, hogy a nitrát is befolyásolja az AMT gének kifejeződését (Babourina et al., 2007).

Minden vizsgált genotípusnál megfigyeltük, hogy a 7. kezelési napon az N0,75 kezelésben a vizsgált gén expressziós szintje magasabb mint a többi N ellátottsági szint KN0 időpontjában mért érték, valamint magasabb mint az N7,50 kezelésben kapott expressziós szintek.

90

Az AMT-t kódoló gén kifejeződésének lefutási görbéje minden fajtában valamelyest hasonlóságot mutatnak a NR-t és NiR-t kódoló gének lefutási görbéivel, főleg a korábbi időpontoknál (7 és 14. kezelési napon). A vizsgált genotípusok mindegyikénél – a Hópehely 7. kezelési napjának kivételével – minden időpontban szignifikáns különbséget tudtunk kimutatni N7,50 és N0,75 kezelések között. A 42.

kezelési napon a White Lady kivételével minden fajtánál az AMT-t kódoló gén felülexpresszálódott az N0,75 kezelésben az N7,50 kezeléshez képest.

Az AS gének expresszióját főleg a fény és a növény szöveteinek szén-nitrogén aránya szabályozza (Herrera-Rodríguez et al., 2002). Más szerzők eredményeihez hasonlóan (Li et al., 2010) saját kísérleteinkben is találtunk szignifikáns eltéréseket a különböző nitrát koncentráción nevelt növényekben az AS gén kifejeződésében.

Minden vizsgált genotípusnál jellemző, hogy az N3,00 kezelésben kapott expressziós értékek hasonlóak az N7,50 kezelésben mért génkifejeződési szintekhez, de az N0,75 kezelésben ezektől eltérő értékeket és lefutási görbéket kaptunk. Az S440, Katica és Chipke genotípusoknál az utolsó mérési időpontban az N0,75 alul expresszálódott az N7,50-hez képest. A White Lady és Hópehely fajtákban a gén az N3,00 és N0,75 kezelésekben felül expresszálódott az N7,50 kezeléshez képest. Az N7,50 kezeléstől való szignifikáns eltéréseket legtöbb esetben N0,75 kezelésben kaptunk.

Más szerzők eredményeihez hasonlóan (Li et al., 2010; Li et al., 2012), mi is megfigyeltük a különböző N ellátás mellett nevelt növények N táplálkozási kulcsgénjeinek eltérő mértékű génexpresszióját. A vizsgált genotípusok expressziós mintázata is lényegesen különbözött.

6.4 A vizsgált tulajdonságok kapcsolata és alkalmazhatóságuk nitrogén