Metabolikus aktivitással összefüggő fehérje expresszió és metabolit

A metabolikus fehérjék és a vizsgált intracelluláris metabolitok mennyiségi összehasonlítása további egyedi különbségeket mutatott, amikor a fehérje expressziós profilokat a 4 sejtvonalban vetettük össze. Az U251 vad és mutáns sejtvonalak alacsonyabb glikolitikus (HK2, LDHA) aktivitást és párhuzamosan magasabb GLS expressziót mutattak a másik két sejtvonalhoz képest. A reverz Warburg hatásra utaló LDHB mennyiségében nem volt szignifikáns különbség a sejtvonalak között, ez arra utal, hogy a glikolitikus fenotípus az LDHA és HK2 expresszió változással függhet inkább össze. Ha a három alap (nem módosított) sejtvonal GLS expresszióját vizsgáljuk, az mutatta a legegyedibb különbségeket, legalacsonyabb expressziót az U87 sejtekben tapasztaltunk (17. ábra). Az U373-U sejtvonalban a zsírsavoxidációval és acetáthasznosítással összefüggő enzimek expressziója volt a legalacsonyabb, ami a csonka citrátkör és a glutaminolízis fokozott szerepére utal ebben a sejtben. Érdekes, hogy a vad és IDH mutáns fehérjét expresszáló U251 sejtvonalak között jelentős különbséget a metabolikus fehérjék expressziójában nem figyeltünk meg.

Az egyes metabolitok mennyiségét vizsgálva, a laktát/malát arány az U87 sejtekben volt a legmagasabb, ami összefügg a HK2 és LDHA mennyiségi különbségeivel. U373-U sejtvonalban hasonlóan magas glikolitikus enzim expresszió mellett, lényegesen alacsonyabb laktát/malát arányt tapasztaltunk, aminek hátterében a glutamin anaplerózis, a glutamin oxidáció, mint alternatív bioenergetikai folyamat állhat.

Ezzel összefügghet a glutamát mennyiség fokozódása is, ami fokozott glutaminfüggőségre is utalhat ebben a sejtvonalban. Az IDH vad és mutáns sejtvonalak egymáshoz képest hasonlóan magas glikolitikus enzim expresszióval rendelkeznek

67

ugyan, de az IDH mutáció következményeként magas 2-HG onkometabolit szintet igazoltunk LC-MS-sel. Ez jelentősen módosította a metabolitok megoszlását és arányát a mutáns sejtvonalban. Az U251 mIDH sejtekben emelkedett piruvát szintet mutattunk ki az alap U251 sejtekhez képest az alacsony LDHA és legmagasabb GLS expresszió mellett. Ez a csökkent mitokondriális működésre és a metabolit-koncentráció arányokban is megjelenő alacsony OXPHOS kapacitásra hívja fel a figyelmet, amiben a glutaminforrású 2-HG onkometabolit szintnek is van szerepe. Azt, hogy az IDH mutáció kompenzálásában szerepe lehet a metabolikus átrendeződésnek, jól mutatja, hogy az alacsony LDHA szint ellenére a laktát termelés, a Warburg-effektus arányaiban emelkedik az alap U251 sejtvonalban tapasztalthoz képest.

68

17. ábra Metabolikus különbségek az U87, U373-U U251 IDH vad és mutáns humán glioma sejtekben. a. A vizsgált metabolikus enzimek mennyiségi különbségeinek bemutatása reprezentatív Western blot-on b. LC-MS-el mért intracelluláris metabolit koncentrációk jellegzeteségei a négy humán glioma sejtvonalban. A glikolitikus folyamatok jellemzésére a laktát/malát arányt, míg az OXPHOS funkció jellemzésére (citrát / szukcinát) / (fumarát / malát) arányokat használtuk. A jobb oldali kördiagram a mért metabolitok arányát az összes mért metabolithoz viszonyítva mutatja (laktát-LAC, piruvát-PYR, citrát-CIT, α-ketoglutarát-α-KG, szukcinát-SUC, fumarát-FUM, malát-MAL, glutamát-GLU és 2-hidroxiglutarát-2-HG).

69

Mivel a három alap glioma sejtvonalban jelentős metabolikus enzim expresszió különbségeket tapasztaltunk, ennek a három sejtvonalnak vizsgáltuk metabolikus gátlószerekkel szembeni érzékenységét (18.a. ábra) A vizsgált glioma sejtek metabolikus adaptációs, alkalmazkodási képességeit jól mutatja, hogy jelentős mértékű proliferációgátló hatást gyakorlatilag egyik kezelés esetében sem tapasztaltunk sem Alamar Blue, sem SRB proliferációs teszttel. Az Alamar Blue és az SRB tesztek eltérő eredményei is arra utalnak, hogy Alamar Blue esetében a mitokondriális kompenzáció jelét és nem feltétlen proliferáció fokozódást figyeltünk meg. Mindezek alapján mindig érdemes összevetni a kapott egyéb eltérésekkel a proliferációs eredményeket és legalább két különböző típusú proliferációs teszt eredményét figyelembe venni szenzitivitás értékelésében. A GLS gátlás (BPTES), a zsírsavszintézis-gátlás (etomoxir) és a doxycycline kezelés után lényeges proliferációgátlást nem tudtunk kimutatni gyakorlatilag egyik sejt esetében sem. Érdekes, hogy az autofágia indukáló mTOR gátlók (rapamycin) és gátló (chloroquine) kezelések sejtvonalfüggő növekedés gátló hatásokat okoztak. Összeségében ez a két kezelés a leginkább az U373-U sejtek proliferációját gátolta. Ebben a sejtvonalban megvizsgáltuk a különböző gátlószerek fehérje expressziókra gyakorolt hatásait is Western blot és WES technikával (18. a.b. ábra). A BPTES, a doxycycline és az etomoxir monoterápia kezelések sem proliferációs hatásokat sem jelentős fehérje vagy foszfo-protein expresszió változást nem mutattak. Az utóbbi két kezelésben csak az AMPK markáns aktivációját tapasztaltuk. A kemoterápiás temozolomide rezisztencia mellett szintén jelentős mértékben megmaradó mTORC1 aktivitást (enyhe p-mTOR és p-S6 expresszió csökkenés) és mTORC2 aktivitás eltolódást (fokozódó p-(Ser473)-Akt és Rictor expresszió), valamint CPT1A és LC3 expresszió fokozódást, lipolitikus metabolikus eltolódást figyeltünk meg. Ezek egymással összefüggő potenciális kompenzációs anyagcsereváltozásokat mutatnak. Rapamycin kezelést követően egyrészt a várt mTOR aktivitás csökkenést (p-S6 és p-mTOR), mTORC2 aktivációt és a temozolomide esetében is tapasztalt lipolitikus kompenzációs (CPT1A és LC3 expresszió emelkedés) hatásokat tapasztaltuk mérsékelt proliferációs hatások mellett. Egymással ebben az esetben is összefüggő metabolikus átrendeződést és enyhe, már szignifikáns proliferáció csökkenést mutattunk ki. A chloroquine monoterápiát ellentmondásos metabolikus változások jellemezték az U373-U sejteket.

Így például, érintetlen glikolítikus enzim expresszió mellett mTORC1 aktivitás változás

70

nélkül, p-(Ser)-Akt fehérje emelkedést; de Rictor fehérje lebomlására utaló jeleket;

párhuzamosan lipid anyagcsereváltozásokat; GLS expresszió csökkenést, ill.

mitokondriális COXIV expresszió csökkenést figyeltünk meg. Mindezek jelentősebb metabolikus zavarral és ennek jelentős proliferációt gátló hatásaival lehetnek összefüggésben.

18. ábra. Rapa, TMZ és metabolikus inhibitor érzékenységek humán high grade glioma sejtvonalakban. A kemoterápiás és metabolikus kezelések (Rapa - rapamycin 50 ng/ml; TMZ - temozolomide 100 μM; Doxy - doxycycline 10 μM; Etom - etomoxir 50 μM; Chl chloroquine 50 μM; BPTESbisz2 (5fenilacetoamid1,3,4tiadiazol2il) -etil-szulfid 10 μM, 72 órás kezelés esetében) anti-proliferatív hatását Alamar Blue (AB) és SRB tesztekkel mutattuk ki U251, U87 és U373-U sejteken (a.). A szignifikáns (p<0,01) változásokat *-al jelöltük. b. A metabolikus adaptáció mechanizmusára utaló fehérje expressziós változásokat is elemeztük Western blot, vagy WES Simple módszerrel az U373-U sejtvonalban.

71