3.2.1 Humán gliomás és emlőcarcinomás biopsziás minták vizsgálata
Jól jellemzett izocitrát-dehidrogenáz (IDH) vad típusú (n=10), ill. IDH mutáns (n=8) humán glioblastoma és high grade astrocytoma biopsziás mintákat kerestünk az intézeti archivált anyagban. A betegeket a Klinikai Idegtudományi Országos Intézetben (Magyarország, Budapest) 2014. január 1. és 2015. december 31. között műtötték. Az IDH mutáció vizsgálat mellett 1p19 kópia szám emelkedést is vizsgáltuk, két esetben 1p19q triszómiát, ill. tetraszómiát állapítottunk meg. Vizsgálatainkban kontroll szövetként peritumorális agyszöveti blokkokat használtunk (n=4). Az összes esetet az intézet patológusai felülvizsgálták és újra osztályozták az Egészségügyi Világszervezet 2016. évi központi idegrendszeri daganatok besorolása (205) alapján.
56
Klinikailag hosszú ideje követett 20-20 és LumA, LumB, HER2+, ill. tripla negatív emlőcarcinomás eset blokkjait, illetve normál emlőszöveteket (n=4), valamint a daganatok elérhető klinikai adatoait gyűjtöttük össze immunhisztokémiai (IHC) vizsgálatainkhoz. A tumortípusokat a 2013-as St.-Gallen-i Konszenzus ajánlása alapján határozták meg (262). A daganatokat és a normál szöveteket műtéti reszekcióval távolították el a Semmelweis Egyetem (Budapest, Magyarország) I. sz. Sebészeti Osztályán 1999. augusztus és 2019. december között. A patológiai analízist a Semmelweis Egyetem II. sz. Patológiai Intézetében végezték (Budapest, Magyarország).
Az összes daganat primer lézió volt és egyetlen beteg sem kapott kezelést műtét előtt. A klinikopatológiai adatokat az orvosi nyilvántartásokból szereztük be. A távoli metasztázismentes túlélést (DMFS) az elsődleges emlőcarcinoma első diagnosztizálása és a távoli metasztázis megjelenésének időpontja között eltelt időt a klinikai adatokból állapotíttuk meg, a teljes túlélést (OS) pedig a diagnózis és a Belügyminisztérium nyilvántartási lekérdezése napjáig (2019.11.25.) határoztuk meg. Az archivált szövetmintákat a Magyar Tudományos Tanács Országos Tudományos Kutatási Etikai Bizottságának jóváhagyásával használtuk (7/2006. Sz., 14383-2/2017/EKU).
3.2.2 Immunhisztokémiai reakciók humán tumorszövetek multiblokkjain
A gliomás szövetek immunhisztokémiai vizsgálatát szöveti multiblokk (TMA) metszeteken végeztük. Betegenként két mintát használtunk a TMA blokkok elkészítéséhez és a tumor heterogenitás miatt legalább két darab 2 mm átmérőjű szövethengert helyeztünk egy-egy esetből egy TMA blokkba. A reprezentatív területeket egy neuropatológussal jelöltük ki. A gyűjtött emlőcarcinomás esetekben teljes metszeteket használtunk fel.
Deparaffinálás után magas nyomású, nedves antigén feltárát végeztünk (0,1 M-os citrát-puffer, pH6.0, elektromos kukta 3 x 7 perc). A szobahőmérsékletű metszeteket a primer antitestekkel 90 percig, Novolink poszt-primer reagenssel 30 percig, utána NovoLink Polimerdetektáló rendszerrel szintén 30 percig inkubáltuk, végül a reakciót DAB-peroxidáz (Dako) kromogént-szubsztráttal tettük láthatóvá amit hematoxilin magfestéskövetett. 0–3+ skálát használtunk az immunreaktivitás szemikvantitatív elemzéséhez, amelyet két független patológus határozott meg (a Panoramic Viewer
57
software segítségével – 3D Histech) az alábbiak szerint: nincs festődés 0; gyenge 1+;
köztes festődés 2+; ill. erős festődés 3+. A H (,,hiszto”)-score értékeket két független patológus adta meg 0 és 300 között, úgy, hogy a festési intenzitást (0-3 +) megszorozta a pozití tumorsejtek intenzitásának százalékával (0-100%) (263).
A két vizsgálat során a következő ellenanyagokat használtuk: p-mTOR(Ser2448) (1:100; #2976; Cell Signaling Technology – CST); p-S6 (Ser 235/236) (1:100; #2211;
CST); Rictor (1:1000 A500-002A; Bethyl); p-Akt-(Ser473) (p-Akt, 1:100; #4060; CST), GLS (1:200 #156876; Abcam), LDHA (1:400 #8337; CST), CPT1A (1: 500 #128568;
Abcam), FASN (1:100, #3180; CST), anti-acetil-koenzim A szintáz short-chain family member 2 (ACSS2; 1:100; #3658; CST).
3.2.3 Hagyományos és kapilláris Western blot (WES Simple) vizsgálatok
Az in vitro sejtvonalak fehérje expressziós vizsgálatához Western blot és WES Simple technikát is felhasználtunk. A Western blot analízisben a kísérletek után a letapadt sejteket 3x mostuk, majd még a tenyésztő flaskákban lizáltuk (150mM NaCl, 50mM Tris-HCl, 10mM NaF, 10% tömény glicerol, 1% NP40, 1% PMFS, 2% NaVO4, 1% proteáz inhibitor koktél) A vizsgálatokban a sejtlizátumok fehérjekoncentrációit Bradford reagenssel (Bio-Rad) határoztuk meg. A Western blot analízisben mintánként 20-40 μg fehérjét SDS-PAGE elektroforézissel választottunk el, majd nedves blottolással PVDF membránra (Bio-Rad) blottoltuk a fehérjéket. A membránokat inkubáltuk az elsődleges antitestekkel egy éjszakán át 4°C-on. Majd megfelelő mosások közbeiktatásával Vectastain Elite ABC Kit (Vector) másodlagos előhívó kitet és kemilumineszcencens előhívást (Thermo Fisher Scientific, ECL Western blotting Substrate) alkalmaztunk C-digit (LI-COR) fotodokumentációs rendszerben. Minden membrán esetében az anti-β-aktinnal (1:5000, #A2228; Merck-Sigma Aldrich) – mint loading kontroll – is elvégeztük az elemzéseket. Az alábbi elsődleges antitesteket használtuk: anti-p-mTOR (Ser2448, 1:1000, #2971; CST), anti-p-S6 (Ser 235/236, 1:1000, #2211; CST), anti-Rictor (1:1000,
#2140; CST), anti-Raptor (1:500, #89603; Novus), anti-mTOR (1:1000, #2938; CST), anti-S6 (1:1000, #2317; CST), anti-laktát-dehidrogenáz A (LDHA, 1:1000, #3582; CST), anti-glutamináz (GLS, 1:1000; #156876; Abcam), anti-GLUT1 (1:1000, #652; Abcam), anti-β-F1-ATP-ase (1:2000, #14370; Abcam), anti-GAPDH (1:2500, mca2427; Serotec),
58
anti-pan-Akt (1:1000, #2920; CST), anti-p-(Ser473)-Akt 1 (p-Akt, 1:2000, #4060; CST), anti-foszfofruktokináz-P (PFKP, 1:1000, #8164; Abcam), anti-hexokináz-2 (HK2, 1:1000, #2867; CST) anti-ASCT2 (1:2000, #A304-353A; Bethyl), anti-lactate dehydrogenase B (LDHB; 1:2000; #85319, Abcam) anti-carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A; 1:1000; #128568, Abcam), anti-fatty acid synthase (FASN; 1:1000; #3180, CST) anti-acyl-coenzyme A synthetase short-chain family member 2 (ACSS2; 1:1000;
#3658, CST), anti-pyruvate dehydrogenase (PDH; 1:1000; #3205, CST), anti-p-ATP-citrát-liáz (p-Acly, 1:1000, CST, CST #4331) és anti-p-AMPK (Thr172) (1:1000, CST
#2535).
A WES Simple analízist (WES System – ProteinSimple-Biotechne 004–600) a gyártó utasításai szerint végeztük. A 12–230 kDa-os kapilláris modulokkal (ProteinSimple SM-W004), illetve anti-nyúl (ProteinSimple DM-001), anti-egér (ProteinSimple DM-002) vagy anti-egér-biotin-avidin-HRP-s előhívórendszert (#7076;
CST) kombináltan alkalmaztunk az elsődleges antitestektől függően. Röviden: egyforma fehérjekoncentrációjú glioma és emlő sejtmintát (0,2 vagy 1 μg/μl az alkalmazott másodlagos antitesttől függően) fluoreszcens Master Mix-ben hígítottunk, majd 95°C-on 5 percig denaturáltuk a fehérjéket. A mintákat, a blokkoló reagenst (antitesthígító), az elsődleges és a másodlagos antitesteket, valamint a kemilumineszcens szubsztrátot a plate-re pipettáztuk. A WES alapértelmezett beállításai a következők voltak: elválasztás és bekötés 395 V-on 30 percig; blokkoló reagens 5 percig, elsődleges és másodlagos ellenanyagok egyaránt 30 percig; luminol/peroxid kemilumineszcens előhívás 15 percig (az antitestek expozíciós idejét 1 és 512 s között). Az elektroferogrammokat ellenőriztük, majd az automatikus csúcsértékelést manuálisan korrigáltuk, ha szükséges volt. A következő elsődleges ellenanyagokat 1:50-es hígításban használtuk: p-mTOR(Ser2448) (p-mTOR, #2971; CST), p-Ser235/236-S6 (#4858; CST), anti-Rictor (#2140; CST), anti-Raptor (#89603; Novus), anti-laktát-dehidrogenáz A (LDHA,
#3582; CST), anti-glutamináz (GLS, #156876; Abcam), anti-GAPDH (mca2427;
Serotec), anti-p-(Ser473)-Akt (p-Akt, #4060; CST), anti-foszfofruktokináz-P (PFKP,
#8164; Abcam), karnitin-palmitoil-transzferáz 1A (CPT1A; #128568, Abcam), anti-fatty acid szintáz (FASN; #3180, CST) anti-acetil-koenzim A szintáz short-chain family member 2 (ACSS2; #3658, CST), anti-piruvát dehidrogenáz (PDH; #3205, CST), p-ATP-citrát-liáz (p-Acly, #4331, CST), és p-Thr172-AMPK (#2535, CST),
anti-59
citokróm c oxidáz (COXIV, #4850, CST), és mikrotubulushoz társult fehérje 1A/1B-könnyűlánc 3 (LC3, 110–57179, Novus).