In vitro kezelések - In vitro, in vivo modellek

3.1 In vitro, in vivo modellek

3.1.2 In vitro kezelések

Az mTOR aktivitás tumornövekedés gátló és egyéb hatásait többféle mTOR útvonal gátlóval (mTORC1 gátló rapamycin – Rapa– Merck-Sigma Aldrich – 50 ng/ml;

Akt és mTOR kináz gátló NVP-BEZ235 – BEZ – Cayman Chemical – 1 μM; mTORC1 és mTORC2 komplex gátló PP242 – PP – Tocris – 1 μM; ill. Akt kináz gátló GDC0068 – GDC – Cayman Chemical – 1 μM) vizsgáltuk. Egyéb metabolikus folyamatok szerepét lipidanyagcsere (zsírsavszintézis gátló BMS-303141 – BMS – 10 μM, zsírsavoxidáció gátló etomoxir – Etom – 50 µM, glikolízis gátló 3-brómpiruvát – 3BP – 100 µM, glutaminolízis gátló bisz-2-(5-fenilacetoamid-1,3,4- tiadiazol-2-il)-etil szulfid – BPTES – 10 μM) kezelésekkel, illetve mitokondriális funkció gátló (doxycycline – Doxy – 10

μM) és autofágia gátló chloroquine kezeléssel – Chl – 50 μM) teszteltük. Kemoterápiás szerként a glioma sejtvonalak esetében temozolomide-ot – TMZ – 100 µM), míg az emlőcarcinoma sejtek vizsgálatában doxorubicint (Doxo – 50 ng/ml) használtunk. A rapamycin az mTORC1-et, a BEZ a PI3K/mTOR-t, míg a PP az mTORC1/mTORC2-t gátolja. Az alkalmazott gátlószer-koncentrációkat a munkacsoport előző eredményei alapján választottuk ki. Kontroll kezelésekben a hatóanyagok oldószereinek (pl. DMSO) megfelelő mennyiségeit alkalmaztuk. A kezeléseket a sejtek letapadását követően (24 h inkubáció), médiumcsere és kezelőszer hozzáadása után általában 72 óráig végeztük (amennyiben ezektől eltérően jártunk el, azt külön jelöltük). A különféle gátlószerkombinációk additív vagy szinergista hatásainak elemzésére kombinációs indexet (CI) használtunk. A CI-t (EA+EB)/EAB-ként számoltuk, ahol az EA és az EB a monoterápia egyedi hatása, az EAB pedig a megfigyelt kombinációs hatás. Amennyiben a CI értéke 0 és 1 közötti értéket vett fel akkor nem volt hatása. Abban az esetben, ha CI értéke 1 akkor additívnak, míg 1 feletti érték esetén szinergetikusnak tekintettük a kombinációk hatását (261). Ahol a reagenseknél jelzés nem szerepel, azokat a Merk-Sigma Aldrich cégtől szereztük be.

3.1.3 In vitro proliferációs vizsgálatok

A sejtkultúrák proliferációjának Alamar Blue (AB, Thermo Fisher Scientific) vagy szulforodamine B (SRB) teszteket alkalmaztunk 96-lyukú plate-en. Az AB-t a kezelés utolsó 4 órájában adtuk a sejtekhez 10 μg/ml végső koncentrációban; a fluoreszcenciát Fluoroskan Ascent FL fluoriméterrel (Labsystems International; Ascent software) mértük 570-590 nm-en. Az SRB teszt lépései: 1 órás 10%-os triklór-ecetsavas inkubálás 4°C-on, majd 0,4 m/V% SRB inkubálás 15 percig, ezt követően 10 mM-os Tris-bázis hozzáadása a fehérje-festék kioldásához. Az abszorbanciát 570 nm-en mértük Multiskan MS mikroplate leolvasóval (Labsystems International; Transmit software).

Mindegyik kezelésnél legalább három független kísérletet végeztünk el legalább hat párhuzamossal. A proliferáció százalékos arányát a kontroll mintákhoz viszonyítva, annak %-ában adtuk meg.

3.1.4 Xenograft modell létrehozása ZR75.1 humán emlő carcinoma sejtekkel – in vivo vizsgálatok

A xenograft tumormodellt állatházi dolgozók segítségével súlyos kombinált immunhiányos (SCID) egerekben hoztuk létre. A ZR75.1 sejteket 8-10 hetes, 20-23 g tömegű SCID egerek emlő régiójába injektáltuk (2,5x10⁶) szubkután. Amikor a daganatok tapinthatók voltak (kb. 1 hónap), az állatokat kontroll, Rapamune-, doxorubicin- és doxycycline-monoterápiás, Rapamune+doxorubicin és Rapamune+doxycycline kombinációs csoportokra osztottuk (n=5 mindegyik csoportban). A kontroll csoportot fiziológiás sóoldattal kezeltük. A Rapamune-t (1 mg/ml, Wyeth Europa Ltd., 3 mg/testtömeg kg, per os) és a doxycycline-t (200 mg/testtömeg kg, intravénásan) hetente háromszor, míg a doxorubicint (2 mg/ml, TEVA – 2 mg/testtömeg kg, intravénásan) heti egyszer adtuk három héten át. A testtömeget és a tumor méretét minden héten háromnaponta regisztráltuk. A kísérlet végén megmértük a tumorok tömegét. A tumortérfogat meghatározásához a következő képletet használtuk:

п/6×(2xrövidebb átmérő+hosszabb átmérő)/3)³. A tumorokat lefagyasztottuk, valamint formalinnal fixálást követően paraffinos szövetblokkokat késztettünk. Az in vivo kísérleteket az intézetünk állatházának hivatalos engedélyével végeztük, amelyet az etikai felülvizsgálati testület hagyott jóvá (PEI/001/2457-6/2015), (PEI/001/1733-2/2015).

3.2 Fehérjeszintű expressziós vizsgálatok

3.2.1 Humán gliomás és emlőcarcinomás biopsziás minták vizsgálata

Jól jellemzett izocitrát-dehidrogenáz (IDH) vad típusú (n=10), ill. IDH mutáns (n=8) humán glioblastoma és high grade astrocytoma biopsziás mintákat kerestünk az intézeti archivált anyagban. A betegeket a Klinikai Idegtudományi Országos Intézetben (Magyarország, Budapest) 2014. január 1. és 2015. december 31. között műtötték. Az IDH mutáció vizsgálat mellett 1p19 kópia szám emelkedést is vizsgáltuk, két esetben 1p19q triszómiát, ill. tetraszómiát állapítottunk meg. Vizsgálatainkban kontroll szövetként peritumorális agyszöveti blokkokat használtunk (n=4). Az összes esetet az intézet patológusai felülvizsgálták és újra osztályozták az Egészségügyi Világszervezet 2016. évi központi idegrendszeri daganatok besorolása (205) alapján.

Klinikailag hosszú ideje követett 20-20 és LumA, LumB, HER2+, ill. tripla negatív emlőcarcinomás eset blokkjait, illetve normál emlőszöveteket (n=4), valamint a daganatok elérhető klinikai adatoait gyűjtöttük össze immunhisztokémiai (IHC) vizsgálatainkhoz. A tumortípusokat a 2013-as St.-Gallen-i Konszenzus ajánlása alapján határozták meg (262). A daganatokat és a normál szöveteket műtéti reszekcióval távolították el a Semmelweis Egyetem (Budapest, Magyarország) I. sz. Sebészeti Osztályán 1999. augusztus és 2019. december között. A patológiai analízist a Semmelweis Egyetem II. sz. Patológiai Intézetében végezték (Budapest, Magyarország).

Az összes daganat primer lézió volt és egyetlen beteg sem kapott kezelést műtét előtt. A klinikopatológiai adatokat az orvosi nyilvántartásokból szereztük be. A távoli metasztázismentes túlélést (DMFS) az elsődleges emlőcarcinoma első diagnosztizálása és a távoli metasztázis megjelenésének időpontja között eltelt időt a klinikai adatokból állapotíttuk meg, a teljes túlélést (OS) pedig a diagnózis és a Belügyminisztérium nyilvántartási lekérdezése napjáig (2019.11.25.) határoztuk meg. Az archivált szövetmintákat a Magyar Tudományos Tanács Országos Tudományos Kutatási Etikai Bizottságának jóváhagyásával használtuk (7/2006. Sz., 14383-2/2017/EKU).

3.2.2 Immunhisztokémiai reakciók humán tumorszövetek multiblokkjain

A gliomás szövetek immunhisztokémiai vizsgálatát szöveti multiblokk (TMA) metszeteken végeztük. Betegenként két mintát használtunk a TMA blokkok elkészítéséhez és a tumor heterogenitás miatt legalább két darab 2 mm átmérőjű szövethengert helyeztünk egy-egy esetből egy TMA blokkba. A reprezentatív területeket egy neuropatológussal jelöltük ki. A gyűjtött emlőcarcinomás esetekben teljes metszeteket használtunk fel.

Deparaffinálás után magas nyomású, nedves antigén feltárát végeztünk (0,1 M-os citrát-puffer, pH6.0, elektromos kukta 3 x 7 perc). A szobahőmérsékletű metszeteket a primer antitestekkel 90 percig, Novolink poszt-primer reagenssel 30 percig, utána NovoLink Polimerdetektáló rendszerrel szintén 30 percig inkubáltuk, végül a reakciót DAB-peroxidáz (Dako) kromogént-szubsztráttal tettük láthatóvá amit hematoxilin magfestéskövetett. 0–3+ skálát használtunk az immunreaktivitás szemikvantitatív elemzéséhez, amelyet két független patológus határozott meg (a Panoramic Viewer

software segítségével – 3D Histech) az alábbiak szerint: nincs festődés 0; gyenge 1+;

köztes festődés 2+; ill. erős festődés 3+. A H (,,hiszto”)-score értékeket két független patológus adta meg 0 és 300 között, úgy, hogy a festési intenzitást (0-3 +) megszorozta a pozití tumorsejtek intenzitásának százalékával (0-100%) (263).

A két vizsgálat során a következő ellenanyagokat használtuk: p-mTOR(Ser2448) (1:100; #2976; Cell Signaling Technology – CST); p-S6 (Ser 235/236) (1:100; #2211;

CST); Rictor (1:1000 A500-002A; Bethyl); p-Akt-(Ser473) (p-Akt, 1:100; #4060; CST), GLS (1:200 #156876; Abcam), LDHA (1:400 #8337; CST), CPT1A (1: 500 #128568;

Abcam), FASN (1:100, #3180; CST), anti-acetil-koenzim A szintáz short-chain family member 2 (ACSS2; 1:100; #3658; CST).

3.2.3 Hagyományos és kapilláris Western blot (WES Simple) vizsgálatok

Az in vitro sejtvonalak fehérje expressziós vizsgálatához Western blot és WES Simple technikát is felhasználtunk. A Western blot analízisben a kísérletek után a letapadt sejteket 3x mostuk, majd még a tenyésztő flaskákban lizáltuk (150mM NaCl, 50mM Tris-HCl, 10mM NaF, 10% tömény glicerol, 1% NP40, 1% PMFS, 2% NaVO4, 1% proteáz inhibitor koktél) A vizsgálatokban a sejtlizátumok fehérjekoncentrációit Bradford reagenssel (Bio-Rad) határoztuk meg. A Western blot analízisben mintánként 20-40 μg fehérjét SDS-PAGE elektroforézissel választottunk el, majd nedves blottolással PVDF membránra (Bio-Rad) blottoltuk a fehérjéket. A membránokat inkubáltuk az elsődleges antitestekkel egy éjszakán át 4°C-on. Majd megfelelő mosások közbeiktatásával Vectastain Elite ABC Kit (Vector) másodlagos előhívó kitet és kemilumineszcencens előhívást (Thermo Fisher Scientific, ECL Western blotting Substrate) alkalmaztunk C-digit (LI-COR) fotodokumentációs rendszerben. Minden membrán esetében az anti-β-aktinnal (1:5000, #A2228; Merck-Sigma Aldrich) – mint loading kontroll – is elvégeztük az elemzéseket. Az alábbi elsődleges antitesteket használtuk: anti-p-mTOR (Ser2448, 1:1000, #2971; CST), anti-p-S6 (Ser 235/236, 1:1000, #2211; CST), anti-Rictor (1:1000,

#2140; CST), anti-Raptor (1:500, #89603; Novus), anti-mTOR (1:1000, #2938; CST), anti-S6 (1:1000, #2317; CST), anti-laktát-dehidrogenáz A (LDHA, 1:1000, #3582; CST), anti-glutamináz (GLS, 1:1000; #156876; Abcam), anti-GLUT1 (1:1000, #652; Abcam), anti-β-F1-ATP-ase (1:2000, #14370; Abcam), anti-GAPDH (1:2500, mca2427; Serotec),

anti-pan-Akt (1:1000, #2920; CST), anti-p-(Ser473)-Akt 1 (p-Akt, 1:2000, #4060; CST), anti-foszfofruktokináz-P (PFKP, 1:1000, #8164; Abcam), anti-hexokináz-2 (HK2, 1:1000, #2867; CST) anti-ASCT2 (1:2000, #A304-353A; Bethyl), anti-lactate dehydrogenase B (LDHB; 1:2000; #85319, Abcam) anti-carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A; 1:1000; #128568, Abcam), anti-fatty acid synthase (FASN; 1:1000; #3180, CST) anti-acyl-coenzyme A synthetase short-chain family member 2 (ACSS2; 1:1000;

#3658, CST), anti-pyruvate dehydrogenase (PDH; 1:1000; #3205, CST), anti-p-ATP-citrát-liáz (p-Acly, 1:1000, CST, CST #4331) és anti-p-AMPK (Thr172) (1:1000, CST

#2535).

A WES Simple analízist (WES System – ProteinSimple-Biotechne 004–600) a gyártó utasításai szerint végeztük. A 12–230 kDa-os kapilláris modulokkal (ProteinSimple SM-W004), illetve anti-nyúl (ProteinSimple DM-001), anti-egér (ProteinSimple DM-002) vagy anti-egér-biotin-avidin-HRP-s előhívórendszert (#7076;

CST) kombináltan alkalmaztunk az elsődleges antitestektől függően. Röviden: egyforma fehérjekoncentrációjú glioma és emlő sejtmintát (0,2 vagy 1 μg/μl az alkalmazott másodlagos antitesttől függően) fluoreszcens Master Mix-ben hígítottunk, majd 95°C-on 5 percig denaturáltuk a fehérjéket. A mintákat, a blokkoló reagenst (antitesthígító), az elsődleges és a másodlagos antitesteket, valamint a kemilumineszcens szubsztrátot a plate-re pipettáztuk. A WES alapértelmezett beállításai a következők voltak: elválasztás és bekötés 395 V-on 30 percig; blokkoló reagens 5 percig, elsődleges és másodlagos ellenanyagok egyaránt 30 percig; luminol/peroxid kemilumineszcens előhívás 15 percig (az antitestek expozíciós idejét 1 és 512 s között). Az elektroferogrammokat ellenőriztük, majd az automatikus csúcsértékelést manuálisan korrigáltuk, ha szükséges volt. A következő elsődleges ellenanyagokat 1:50-es hígításban használtuk: p-mTOR(Ser2448) (p-mTOR, #2971; CST), p-Ser235/236-S6 (#4858; CST), anti-Rictor (#2140; CST), anti-Raptor (#89603; Novus), anti-laktát-dehidrogenáz A (LDHA,

#3582; CST), anti-glutamináz (GLS, #156876; Abcam), anti-GAPDH (mca2427;

Serotec), anti-p-(Ser473)-Akt (p-Akt, #4060; CST), anti-foszfofruktokináz-P (PFKP,

#8164; Abcam), karnitin-palmitoil-transzferáz 1A (CPT1A; #128568, Abcam), anti-fatty acid szintáz (FASN; #3180, CST) anti-acetil-koenzim A szintáz short-chain family member 2 (ACSS2; #3658, CST), anti-piruvát dehidrogenáz (PDH; #3205, CST), p-ATP-citrát-liáz (p-Acly, #4331, CST), és p-Thr172-AMPK (#2535, CST),

anti-59

citokróm c oxidáz (COXIV, #4850, CST), és mikrotubulushoz társult fehérje 1A/1B-könnyűlánc 3 (LC3, 110–57179, Novus).

3.3 Metabolitok extrakciója és mennyiségi meghatározása tömegspektrometriával

Az intracelluláris metabolitokat – laktát (LAC), piruvát (PYR), citrát (CIT), α-ketoglutarát (αKG), szukcinát (SUC), fumarát (FUM), malát (MAL), glutamát (GLU), aszpartát (ASP) – néhány módosítással Szoboszlai és mtsai. közleménye alapján extraháltuk (264). A intermedier metabolitokat a sejtekből és a felülúszókból metanol-kloroform-víz (9:1:1) eleggyel extraháltuk, majd 4°C-on lecentrifugáltuk (15 000×g, 10 perc, 4°C). A mérésig a felülúszókat -80°C-on tároltuk. A laktát-, piruvát-, citrát-, αKG-, szukcinát-αKG-, fumarát-αKG-, malát-αKG-, glutamát- és aszpartát-koncentrációkat kalibrációs görbék segítségével határoztuk meg az analitikai minőségű standardok hígítási sorainak (0,5–50 μM) mérését követően. A metabolitarányok kiszámításához az adott minták sejtszámára normalizálva ng/10⁶ sejt koncentrációban kerültek megadásra. A folyadék kromatográfia-tömegspektrometriás (LC–MS) mérést a Perkin-Elmer Flexar FX10 ultrateljesítményű folyadék-kromatográf segítségével végeztük, Sciex 5500 QTRAP tömegspektrométerrel kapcsolva. A kromatográfiás elválasztást egy Phenomenex Luna Omega C18 oszlopon (100×2,1 mm,1,6 μm) végeztük (GenLab Ltd.). A mozgófázis vízből és 0,1% (v/v) hangyasavat tartalmazó metanolból állt. Az MS negatív elektrospray ionizációs módban működött. A mérésekhez a következő beállításokat használtuk: állandó hőmérséklet:

300°C ionizációs feszültség: -4000 V, belépési potenciál: - 10V, zárógáz: 35 psi, gáz1:

35 psi, gáz2: 35 psi, CAD-gáz: közepes. A kvantitatív elemzések elvégzéséhez többszörös reakciófigyelő (MRM) módszert alkalmaztunk.

3.4 Metabolikus, illetve mTOR komplex fehérjék génexpressziójának és emlődaganatos betegek klinikai adatainak elemzése a KM-plotter adatbázis felhasználásával

A Kaplan-Meier Plotter adatbázis (KM-plotter; http://www.kmplot.com) segítségével vizsgáltuk meg az mTOR útvonal releváns fehérjéinek és a metabolikus útvonalak egyes enzimeinek mRNS-expressziós adatait, illetve a prognózis közötti összefüggést. Ez a nyílt

hozzáférésű online túlélést elemző adatbázis 3951 emlődaganatos beteg Affimetrix HGU133A és HGU133+2 microarray (Affymetrix, Santa Clara, CA) adatainak elemzését teszi lehetővé (265). Az adatbázis segítségével már a kimutatott mRNS expressziós különbségek prognosztikai értékélését lehet elvégezni, statisztikailag jól kezelhető esetszámmal. A Hazard Ratio-t a legjobb automatikusan kiválasztott cut-off értéknél meghatározva; és a p értéket a log-rank teszttel számítva R-nek ábrázoltuk.

3.5 Statisztikai analízis

Az IBM SPSS Statistics szoftvert (verzió: 22; SPSS Inc.) használtuk a statisztikai elemzések elvégzésére. Az átlagértékeket és az SD-t három független kísérletből számoltuk, legalább hat párhuzamos mellett, az alkalmazott in vitro vizsgálatoktól függően. Mann-Whitney U-tesztet, Fisher-tesztet, log-rank tesztet és Kaplan-Meier-görbe analízist használtunk az IHC fehérjemarkerek prognosztikai értékének (túléléssel való összefüggés összehasonlítás) vizsgálatához. A Hazard Ratio-t Cox regressziós próba segítségével számoltuk ki a vizsgált fehérje H-score értékek és egyéb tényezők többváltozós elemzésében. Student t-tesztet is használtuk a kezelések hatásainak statisztikai számításaihoz. A p≤0,05-öt tekintettük statisztikailag szignifikánsnak.

61 4 Eredmények

4.1 Humán gliomák vizsgálatának eredményei

4.1.1 mTOR jelátviteli útvonal aktivitásával összefüggő fehérjék és metabolikus enzimek expressziója humán gliomákban

PhD munkám elején a labor glioma (IDH mutáns és vad), illetve IDH mutáns fibrosarcoma sejtvonalallal végzett vizsgálataiban az IDH mutáció meglétével és hiányával összefüggő jelentős bioenergetikai különbségeket figyeltünk meg: a. Warburg-effektus intenzitás, acetáthasznosítás és oxidatív foszforiláció aktivitás különbségei, b.

glutamin, illetve a GABA, mint bioenergetikai szubsztrát potenciális jelentősége IDH vad gliomákban. c. mTOR aktivitás szerepe gliomák onkometabolit (laktát és 2-HG) termelésében (Hujber Zoltán Ph.D. disszertációjában bemutatott társszerzős cikkek).

Saját munkámban előbbiek folytatásaként mTOR és metabolikus aktivitással összefüggő fehérjék in situ fehérje expresszió különbségeit hasonlítottam össze normál peritumorális cerebrumban (n=4), illetve IDH vad és mutáns humán glioma mintákban (n=10 és n=8). Az immunhisztokémiai reakciók egyrészt fokozott mTOR, másrészt ezzel összefüggésben és a normál agyszöveténél magasabb metabolikus aktivitást mutattak (14-15. ábra). A normál agyszövet, p-mTOR, p-S6, Rictor és p-(Ser473)-Akt reakciókkal jellemzett alacsony mTOR aktivitásával szemben az IDH mutáns gliomákban közepesen emelkedett, míg az IDH vad típusú gliomákban még jelentősebb p-mTOR, p-S6 és (p-Ser473)-Akt fehérjemennyiség emelkedést figyeltünk meg. Ezek az eredmények, a más tumorokban is gyakran megfigyelt, rosszabb prognózissal összefüggő mTORC2 aktivitás emelkedésre utalnak (14. ábra).

Metabolikusan a normál agyszövethez hasonló, az intenzív Warburg glikolízisre utaló egyformán magas LDHA expresszió jellemezte a gliomákat. A zsírsavszintézis FASN enzimének expressziója lényeges különbséget nem, a lipidoxidáció szubsztrátjainak mitokondriális mátrixtranszportjában fontos szerepet játszó CPT1A és az acetát hasznosítással összefüggő ACSS2 mennyisége azonban jelentős emelkedést mutatott mindkét glioma típusban. Az IDH vad típusú gliomákat – a GLS expresszió kivételével – kifejezetten magas általános metabolikus enzimexpresszió jellemezte, ami szubsztrát felhasználásuk sokoldalúságára utal. Az IDH mutáns gliomákra ez kevésbé volt jellemző, a vizsgált 8-ból 6 esetben azonban a normál agyszövethez és a vad típusú

gliomákhoz képest is jelentősen emelkedett, karakterisztikus 2/3+ intenzitású GLS expressziót mutattunk ki.

Az IDH mutáción kívül más klinikopatológiai paraméterrel összefüggő expresszió különbséget az alacsony esetszámok miatt sem találtunk, igaz a p-(Ser473)-Akt mennyisége a grade IV glioblastomákban magasabb volt, mint a grade III anaplasztikus astrocytomákban. További szignifikáns összefüggést figyeltünk meg a Ki67 proliferációs index és a FASN expressziója között (Ki67<20% vs. Ki67 ≥20%, p = 0,001) (15. ábra).

14. ábra. mTOR aktivitás függő fehérjék reprezentatív IHC reakciói IDH vad típusú és mutáns humán gliomák metszetein a normál peritumorális cerebruméhoz hasonlítva. DAB kromogén (barna), hematoxilin háttérfestés, a nagyítások a jobb felső sarokban, a metszetek digitalizálása után Panoramic Viewer programmal értékelve.

15. ábra. Metabolikus fehérjék IHC vizsgálatának reprezentatív reakciói humán peritumorális cerebrumban, IDH vad típusú és mutáns gliómákban. DAB kromogén (barna) mellett hematoxilin háttérfestést alkalmaztunk, a nagyításokat feltüntettük, a metszeteket digitalizálása után Panoramic Viewer programmal értékeltük.

4.1.2 mTOR aktivitással összefüggő metabolikus különbségek, valamint temozolomide, illetve mTOR inhibitorok hatásának vizsgálata in vitro humán glioma sejtvonalakban

Az mTORC1 és mTORC2 aktivitással összefüggő fehérjék emelkedett expresszióját figyeltük meg mind a négy glioma sejtvonalban (16. ábra). Az U373-U alacsonyabb Rictor és p-(Ser473)-Akt mennyiséget mutatott, mint a többi vizsgált sejtvonal, ugyanakkor a p-S6 fehérje mennyisége ebben és az U87 sejtvonalban volt a legmagasabb.

A temozolomide – gliomák kemoterápiájában alkalmazott – kezelés in vitro nem mutatott szignifikáns anti-proliferatív hatást egyik vizsgált sejtvonalban sem, még az IDH mutáns glioma sejtekben sem. Az mTOR aktivitást jellemző fehérjék mennyiségével összefüggésben az mTORC1/C2 és dual mTOR inhibitorok szignifikánsan nagyobb proliferációgátlást mutattak, mint a rapamycin és a temozolomide. Az U373-U sejtben megfigyelt alacsonyabb Rictor és p-(Ser473)-Akt mennyisége ellenére jelentősebb hatást tapasztaltunk a dual és a kombinált mTOR gátló kezelésekben. Az U87 és a genetikailag módosított IDH mutáns U251 sejtek bizonyultak a legkevésbé érzékenynek a temozolomide és mTORI kezelésekben.

Utóbbiak alapján a gliomák típusa szempontjából releváns, genetikailag nem módosított három sejtvonalban Western blottal vizsgáltuk az mTOR aktivitásával összefüggő és metabolikus enzim fehérjék mennyiségi változásait 72 órás temozolomide és mTORI kezelések után. A S6 fehérjék mennyiségét mindegyik mTOR inhibitor, a p-4EBP1 mennyiségét azonban csak a NVP-BEZ235 csökkentette. Az mTORC2 aktivitással összefüggő p-(Ser473)-Akt mennyiségének emelkedése valamennyi sejtvonalban jól mutatta a rapamycin gátló hatását, az S6K negatív feedback mechanizmusának hiányát. Ez a foszforilációs változás a dual, illetve az mTORC1/C2 gátló kezelésekben elmaradt. A temozolomide nem volt hatással sem az mTORC1, sem az mTORC2 aktivitására.

Az mTOR inhibitor kezelések más a metabolikus folyamatok aktivitásváltozását jellemző enzimek közül a HK2, FASN és a GLS (kivéve NVP-BEZ235 az U251-ben) mennyiségét csökkentették, míg párhuzamosan a CPT1A és ACSS2 expresszióját fokozták. Utóbbi változások mTOR gátlást követően jelentős metabolikus

átrendeződésekre, az oxidációs, a lipid és acetát szubsztrát felhasználási folyamatok intenzitás emelkedésére utalnak. A temozolomide metabolikus átrendeződést eredményező hatásai kevésbé voltak jellegzetesek és jelentősebb egyedi különbségeket mutattak a sejtekben. A FASN expressziót a temozolomide ugyan csökkentette, de párhuzamosan a CPT1A és a GLS mennyisége nem változott a kezelés hatására. Az ACSS2 és a HK2 expresszióváltozások mutatták leginkább az egyedi jellegzetességeket.

Az ACSS2 expresszió emelkedett, míg a HK2 mennyisége csökkent temozolomide kezelést követően az U251-ben és U373-U-ban, de nem változott a harmadik sejtben.

16. ábra. mTOR aktivitás különbségek, ill. anyagcsere útvonalakkal kapcsolatos egyéb enzimek mennyiségének változásai mTORI (rapamycin – Rapa 50 ng/ml;

NVP-BEZ235 – BEZ 1 µM; PP242 1 µM) és temozolomid (TMZ 100 µM) kezelések (72h) után U87, U373-U, U251 IDH vad és mutáns humán glioma sejtekben. a.

mTOR aktivitás különbségekre utaló fehérje expressziós mintázat reprezentatív Western blot képeken, ill. Alamar Blue és SRB tesztek alapján meghatározott (átlag) TMZ és mTORI érzékenységek bemutatása hőtérképen (piros – 100% gátlás szenzitív; kék 0%

hatás - rezisztens). b. Az mTORC1 és C2 aktivitással kapcsolatos fehérjék és más metabolikus enzimek mennyiségének változása a kezeléseket követően (reprezentatív Western blot eredmények).

4.1.3 Metabolikus aktivitással összefüggő fehérje expresszió és metabolit különbségek, valamint metabolikus gátlószerek hatása glioma sejtvonalakban

A metabolikus fehérjék és a vizsgált intracelluláris metabolitok mennyiségi összehasonlítása további egyedi különbségeket mutatott, amikor a fehérje expressziós profilokat a 4 sejtvonalban vetettük össze. Az U251 vad és mutáns sejtvonalak alacsonyabb glikolitikus (HK2, LDHA) aktivitást és párhuzamosan magasabb GLS expressziót mutattak a másik két sejtvonalhoz képest. A reverz Warburg hatásra utaló LDHB mennyiségében nem volt szignifikáns különbség a sejtvonalak között, ez arra utal, hogy a glikolitikus fenotípus az LDHA és HK2 expresszió változással függhet inkább össze. Ha a három alap (nem módosított) sejtvonal GLS expresszióját vizsgáljuk, az mutatta a legegyedibb különbségeket, legalacsonyabb expressziót az U87 sejtekben tapasztaltunk (17. ábra). Az U373-U sejtvonalban a zsírsavoxidációval és acetáthasznosítással összefüggő enzimek expressziója volt a legalacsonyabb, ami a csonka citrátkör és a glutaminolízis fokozott szerepére utal ebben a sejtben. Érdekes, hogy a vad és IDH mutáns fehérjét expresszáló U251 sejtvonalak között jelentős különbséget a metabolikus fehérjék expressziójában nem figyeltünk meg.

Az egyes metabolitok mennyiségét vizsgálva, a laktát/malát arány az U87 sejtekben volt a legmagasabb, ami összefügg a HK2 és LDHA mennyiségi különbségeivel. U373-U sejtvonalban hasonlóan magas glikolitikus enzim expresszió mellett, lényegesen alacsonyabb laktát/malát arányt tapasztaltunk, aminek hátterében a glutamin anaplerózis, a glutamin oxidáció, mint alternatív bioenergetikai folyamat állhat.

Ezzel összefügghet a glutamát mennyiség fokozódása is, ami fokozott glutaminfüggőségre is utalhat ebben a sejtvonalban. Az IDH vad és mutáns sejtvonalak egymáshoz képest hasonlóan magas glikolitikus enzim expresszióval rendelkeznek

ugyan, de az IDH mutáció következményeként magas 2-HG onkometabolit szintet igazoltunk LC-MS-sel. Ez jelentősen módosította a metabolitok megoszlását és arányát a mutáns sejtvonalban. Az U251 mIDH sejtekben emelkedett piruvát szintet mutattunk ki az alap U251 sejtekhez képest az alacsony LDHA és legmagasabb GLS expresszió mellett. Ez a csökkent mitokondriális működésre és a metabolit-koncentráció arányokban is megjelenő alacsony OXPHOS kapacitásra hívja fel a figyelmet, amiben a glutaminforrású 2-HG onkometabolit szintnek is van szerepe. Azt, hogy az IDH mutáció kompenzálásában szerepe lehet a metabolikus átrendeződésnek, jól mutatja, hogy az alacsony LDHA szint ellenére a laktát termelés, a Warburg-effektus arányaiban emelkedik az alap U251 sejtvonalban tapasztalthoz képest.

17. ábra Metabolikus különbségek az U87, U373-U U251 IDH vad és mutáns humán glioma sejtekben. a. A vizsgált metabolikus enzimek mennyiségi különbségeinek

In document SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA Ph.D. értekezések 2419. PETŐVÁRI GÁBOR (Pldal 55-0)