In situ mTOR és metabolikus fehérje expressziós különbségek

Az emlőcarcinoma szubtípusok metabolikus és mTOR aktivitás jellemzőinek vizsgálata mellett, az egyéni klinikai és túlélési adatok (távoli metasztázis mentes túlélés és teljes túlélés) és az IHC értékelésekben kapott adott fehérjék esetében meghatározott IHC H-score értékek összehasonlítását is el tudtuk végezni. Az adott festések esetében a betegeket alacsony és magas H-score értékű csoportokba osztottuk. A cut-off értéket a medián H-score érték alapján határoztuk meg. 150-es H-score cut-off értéket használtunk a p-S6, Rictor, LDHA és GLS esetében, mivel ezeknél az IHC értékeléseknél a medián H-score 150-200 között volt. A CPT1A és a FASN esetében a magasabb (>200) medián H-score alapján ezt 200-nál határoztuk meg. A magas p-S6 a távoli metasztázis kialakulásával és a betegek korával, az LDHA az altípusokkal, grádussal és a stádiummal mutatott szignifikáns összefüggést.

A magasabb p-S6 H-score szubtípustól függetlenül szignifikánsan összefüggött a távoli metasztázisok megjelenésével, a betegek életkorával és rövidebb metasztázis mentes, valamint rövidebb teljes túléléssel (3. táblázat, 27. ábra). A Rictor esetében nem találtunk összefüggést a túlélési adatokkal. Az LDHA alacsony illetve magas score összefüggött a szubtípussal, HR receptor státusszal (ahogy azt korábbi elemzésünk is mutatta), ezentúl szignifikáns összefüggést mutatott a grádussal és a stádiummal (3.

táblázat) is. Bizonyos összefüggéseket a GLS expresszió és a hosszútávú teljes túlélés tekintetében is mutatott elemzésünk, meglepő, de a magasabb H-score értékek hosszabb túléléssel függtek össze szignifikánsan. Ennek hátterében állhat, hogy in situ a használt ellenanyag a két funkcióiban eltérő GLS izoforma elkülönítésére nem alkalmas. Nem szignifikáns, de tendenciában jelentős különbséget mutatott a CPT1A és FASN H-score értékek és túlélési adatok elemzése is. Ez mutatta a korábban leírt, várt inverz jelleget, miszerint magasabb CPT1A H-score a rosszabb, míg a magasabb FASN H-score a jobb prognózissal függött össze (28. ábra).

84

3. táblázat. Humán emlődaganatos minták mTOR és metabolikus immunreakcióinak klinikopatológiai adatokkal való összefüggései. *p<0,05 és

**p<0,01.

85

28. ábra. Kaplan-Meier analízis a magas és az alacsony H-score betegcsoportokban a távoli metasztázis nélküli (DMFS) és teljes túlélési (OS) adatok felhasználásával.

200 hónapos követés túlélési adatait vizsgáltuk. A medián H-score-ok figyelembevételével 150-es H-score cut-off érték mellett a p-S6, LDHA, GLS és Rictor, míg 200-as H-score cut off érték mellett a FASN és CPT1A in situ expresszió alapján alacsony (zöld) és magas (fekete) expressziójú csoportokat vizsgáltunk az analízisben.

A legérdekesebb túlélési összefüggéseket abban az elemzésben kaptuk, amelyben kombináltan értékeltük az mTOR aktivitást és a többi metabolikus útvonal markereket.

Jó metabolikus alkalmazkodási képességűnek értékeltük (magas metabolikus plaszticitási érték) azokat az eseteket, amelyeknél a mTOR aktivitással összefüggő p-S6 festés H-score értéke mellett még legalább két másik metabolikus útvonal enzim H-H-score értéke magas volt. Ezek alapján nem szignifikánsan, de jelentős mértékben (trendszerűen) összefügg a jó metabolikus alkalmazkodási képessége a vizsgált daganatoknak a rossz prognózissal, a rövidebb távoli metasztázis mentes és teljes túléléssel (29. ábra).

86

Ez az expressziós mintázat, amelyben a vizsgált markerek közül a p-S6 magas H-score mellett legalább két további enzim magas H-H-score értékelést kapott, a négy másik vizsgált közül (LDHA, GLS, FASN vagy CPT1A), még jó prognózisú HR+ szubtípusok esetében is felhívhatja a figyelmet a várható rossz prognózisra, a szorosabb utánkövetésre (30. ábra). Illetve biztató kilátásokat jelenthet olyan TN emlőcarcinomás betegek esetében, ahol az előbbi vizsgált paraméterekkel meghatározott magas metabolikus alkalmazkodó képesség tumorsejtekben nem jelenik meg (30. ábra).

29. ábra. A magas metabolikus plaszticitás erős pozitív tendenciát mutatott az emlődaganatos betegek rosszabb túlélésével. Kaplan-Meier analízissel zöld szín az alacsony, míg fekete a magas metabolikus plaszticitást jelöli. A szignifikancia p értékét megadtuk.

87

30. ábra. Reprezentatív p-S6, Rictor, LDHA, GLS, CPT1A és FASN immunreakciók két emlőcarcinoma esetben. A felső 2 sorban egy magas metabolikus és mTOR aktivitású LumB típusú daganattal (a GLS kivételével) a beteg túlélése csak 38 hónap volt megfelelő kezelés mellett. Míg a másik, TN esetben (alsó 2 sorban) az alacsony H-score értékek hosszú 189 hónapos túléléssel (OS) társultak standard kezelés mellett.

DAB-reakció (barna), hematoxilin magfestés, azonos nagyítások (a képek job felső sarkában).

88

A KM-plotter adatbázis emlőcarcinomás betegek összegyűjtött mRNS expressziós, túlélési és egyéb klinikai adatait és ezek elemzésének lehetőségét felhasználva elvégeztük a vizsgált fehérjékhez kapcsolható gének mRNS expressziós adatainak prognosztikai szempontú analízisét is. Hasonló összefüggéseket találtunk LumA típusú emlőcarcinomás betegek adatainak elemzését követően: a magasabb S6, LDHA és CPT1A, illetve alacsonyabb FASN és GLS mRNS expresszió a rosszabb prognózisú betegek esetében volt jellemző (4. táblázat). Ez alátámasztja a saját in situ fehérje expressziós és mintázat értékelésünk alapján kapott eredményeket (4. táblázat).

A Rictor és az mTOR mRNS-ek esetében eltéréseket mutatott a KM-plotter elemzésünk és a fehérje mintázatok IHC elemzései alapján kapott eredményünk. A Rictor és mTOR fehérjéknek a funkciói nemcsak mennyiségüktől, hanem egyrészt módosulásaiktól (többféle foszfoprotein - pl. mTOR foszforilációk aktivitásszabályozó hatásai), másrészt sejten belüli elhelyezkedésüktől vagy mTOR komplex partnereiktől is jelentősen függenek, ami magyarázatot adhat a különbségekre. Ezentúl az utóbbi két fehérje expressziós és aktivitás különbségeinek szerepe más tumorok esetében is inkább a magas mTOR aktivitás és az mTORC2 komplex (Rictor) jelenlétének rossz prognózisban játszott szerepére hívják fel a figyelmet.

4. táblázat. KM-plotter metaanalízis eredménye mRNS expresszió és klinikai adatok összefüggésében különböző emlődaganat mintákban.

89

További statisztikai elemzéseket végeztünk az adott vizsgált tényezők rizikó becslő értékének meghatározása érdekében. COX regresszió és multivariancia analízis (amelyben figyelembe vettük az életkort, szubtípust, HR státuszt, grade-et és stádiumot) szerint magas p-S6 H-score és az általunk meghatározni javasolt jó metabolikus alkalmazkodó képesség alkalmasak lehetnek rizikó meghatározásra (p-S6 – RR=2.528;

95% CI 1.278 to 5.00; p=0.008, metabolikus plaszticitás score – RR=2.48; 95% CI 1.021 to 6.021; p=0.045). Más általunk vizsgált IHC markerek ilyen szerepét a vizsgált betegszám mellett nem tudtuk igazolni. Ennek eldöntéséhez és a másik két faktor potenciális jelentőségének igazolásához nagyobb esetszámú, multiparametrikus vizsgálatokat igényelne.

4.2.4 Az mTOR gátló kezelések hatásának vizsgálata doxorubicinnel és