5 EREDMÉNYEK ÉS KÖVETKEZTETÉSEK
5.3 A lignocellulózok enzimes hidrolízisével kapcsolatos kutatások
5.3.1 Kísérletek egyedi enzimkomponensekkel
5.3.1.1 Tiszta enzimkomponensek hatása kristályos és amorf tiszta cellulóz hidrolízisében (36. cikk)
A genetikai munka sok esetben az eltérı tulajdonságú enzimek elıállítására képes szervezetek létrehozására irányul. Különösen keresettek a magasabb hıfokoptimummal, eltérı pH optimummal rendelkezı enzimek szintézisére képes rekombinánsok. Ebben a munkánkban két olyan Melanocarpus albomycesbıl származó termostabil cellulázt vizsgáltunk, melyeket rekombináns Trichoderma reeseivel (Haakana és mtsi., 2004) heterológ módon állítottunk elı. A gének kifejeztetésére kétféle formában került sor: (i) az eredeti genetikai szekvencia szerint, illetve (ii) módosított formában, egy idegen, T. reesei eredető cellulóz-kötı modul (CBM) hozzácsatolásával az eredeti kódoló szekvenciához. A fermentlé szőrése és az enzimfehérjék tisztítása után (részletes adatok: Szijártó és mtsi., 2008) került sor az enzimek vizsgálatára. A Cel7A endoglükanázt, valamint a Cel7B cellobiohidrolázt hidrolízis kísérleteinkben tisztított formában pH 6,0-on 50°C-on alkalmaztuk. A vizsgált enzimek hidrolitikus hatását a hidrolízis során keletkezı termékösszetétellel jellemeztük. Miután a kristályosság egyike azoknak a fizikai paramétereknek, melyek a cellulázok mőködését jelentısen befolyásolják, az új Melanocarpus enzimek hidrolizáló képességét két karakteresen különbözı szubsztráton, a kristályos Avicel-en és az ebbıl foszforsavas duzzasztással elıállított amorf cellulózon az un. Walseth cellulózon (PASC) vizsgáltuk. (40. ábra).
A alkalmazott kis enzim dózisok, valamint az a tény, hogy csak egyedi enzimkomponensek hatását vizsgáltuk kis glükánkonverzió értékeket eredményezett, Avicel szubsztrát esetében egyetlen beállítással sem értük el a 10%-ot. PASC szubsztrátnál a legjobb konverziók megközelítették a 40%-ot. Kristályos szubsztráttal szemben a vizsgált CBH nagyobb aktivitással rendelkezett, mint az EG, az amorf cellulózon nem volt jellemzı a különbség a két új enzim hatásában. Azonos enzimdózis (mg fehérje/g S) alkalmazásakor a Cel7A endoglükanázzal 14-szeres, a Cel7B cellobiohidrolázzal 7,5-szeres konverziót értünk el az amorf cellulózon (PASC) a mikrokristályoson (Avicel) elérthez képest. A CBM pozitív hatását más enzimeknél többen leírták (Ståhlberg és mtsi., 1991, Linder és Teeri, 1997), eredményeink az új Melanocarpus enzimekkel alátámasztották ezt a megfigyelést, valamennyi kísérletben jobb konverzió eredményeket kaptunk, amikor Trichoderma CBM-lal kapcsolt Cel7A-t illetve Cel7B-t alkalmaztunk. A pozitív hatás (százalékosan) nagyobb volt Avicel hidrolízisekor, mint PASC-on. Érdekes módon a Avicel hidrolízisekor a CBM léte különösen az endoglükanáz (Cel7A) hatását javította, ami annak Trichoderma eredetével függhet össze. PASC szubsztráton a CBM pozitív hatása mindkét új Melanocarpus enzimnél 40% körüli értéknek adódott.
A kristályos Avicel sokkal ellenállóbb volt, mint az amorf cellulóz, így a hatékony enzimes hidrolízishez jelentısen nagyobb enzimdózisokat alkalmaztunk (5, 10, 20 mg/g szubsztrát).
Sajnos, még a tízszeres enzimdózis sem eredményezett a PASC-on elérthez hasonló konverziót. A Cel7B kíváló hatása az amorf cellulózon ellentmond a CBH-okkal kapcsolatos eddigi tudásunknak (Medve és mtsi., 1998, Kipper és mtsi., 2005). Miután SDS PAGE méréseink nem utaltak szennyezı (endoglükanáz aktivitású) fehérjék jelenlétére, feltételeztük, hogy az új Melanocarpus Cel7B rendelkezik endoglükanáz típusú mellékaktivitással és az eredményezte a PASC jó bontását. Ezt a feltételezést CMC és HEC szubsztrátokkal szemben meghatározott nyomnyi endoglükanáz aktivitások alátámasztották.
0
szubsztrát enzimdózis mellett (50°C, pH 6,0)
A 41. ábrán a Trichoderma és a Melanocorpus eredető CBH mőködését hasonlítjuk össze Avicel és PASC szubsztrátokon (T 50°C, pH 6,0, S 10 g/l (Avicel/PASC), E/S 5 mg fehérje/g S).
0 10 20 30
0 10 20 30
Konverzió (%)
Hidrolízis ideje (óra)
(A) Avicel
0 10 20 30
0 10 20 30
Konverzió (%)
Hidrolízis ideje (óra)
(B) PASC
41. ábra Avicel (A) és PASC (B) konverziója a hidrolízis idı függvényében (■) M. albomyces Cel7B, (□) M. albomyces Cel7B(CBM), (∆) T. reesei
Cel7A, és (▲) T. reesei Cel7A(CBM) alkalmazásával (50°C, pH 6,0)
Avicelen a Trichoderma eredető, PASC-on a Melanocarpus eredető CBH teljesített jobban, mindkét esetben a kötı domént is tartalmazó enzim volt hatásosabb.
A termékeloszlás PASC 1, 5 és 24 órás hidrolízisekor a 42. ábrán látható. Az alkalmazott körülmények között (50°C, pH 6,0) a M. albomyces CBH aktívabb volt amorf szubsztráton, mint a hasonló T. reesei eredető CBH, és a Trichoderma CBH-val ellentétben a hidrolízistermékek között C4 és C5 tagszámú dextrinek is elıfordultak, ami endoglükanáz mellékaktivitásra utal.
0 M. albomyces Cel7A M. albomyces Cel7B T. reesei CBH I core
Koncentráció (mg/l) M. albomyces Cel7A M. albomyces Cel7B T. reesei CBH I core Koncentráció (mg/l) Cellotrióz (C3)
Cellotetraóz (C4) Cellopentaóz (C5)
(B)
42. ábra PASC hidrolízis az enzimkomponensekkel; a termékeloszlás (A: C1, C2 cukrok;
B: C3, C4, C5 cukrok) összehasonlítása T. reesei eredető CBH-val
A szinergizmust mindkét szubsztráton vizsgáltuk (43. ábra).
0
43. ábra Szinergizmus vizsgálata Avicel (A) és Walsheth (B) cellulóz (PASC) hidrolízisekor
□ CBD nélküli Cel7A és Cel7B, ■ Cel7A és Cel7B CBD-vel
A vizsgált enzimek együtt egyértelmő szinergisztikus hatást mutattak mindkét szubsztrát hidrolízisekor (S 10 g/l Avicel ill. PASC, T 50°C, pH 6,0, t 5 h). CBM-t is tartalmazó celluláz komponensek alkalmazásakor a hidrolízis mutatók javultak, a javulás mértéke hangsúlyosabb volt az endoglükanázok esetén, különösen kristályos szubsztráton.
A vizsgált Melanocarpus eredető enzimeknek a Trichodermákénál nagyobb pH optimuma alkalmassá teszi ıket textilipari alkalmazásokra (mosószeripar, farmer anyagok „kımosása”) amelyet eredményeink, miszerint már 50°C-on összemérhetı eredményt produkálnak a hagyományos (ipari) enzimekkel (41. ábra) mindenképp megerısítenek, annál is inkább, mert a vizsgált enzimek hımérsékleti optimuma 50°C feletti.
5.3.1.2 Tiszta enzimkomponensek és segítı enzimek alkalmazása lignocellulóz szubsztrátok hidrolízisében
(37. cikk)
A növényi sejtfal egyik leglényegesebb hemicellulóz komponense a xiloglükán, mely közvetlenül a cellulóz rostokkal asszociálva fordul elı. Kísérleti munkánkban azt vizsgáltuk, hogy miként befolyásolja a xiloglükanáz enzim adagolása a glükán illetve a xilán konverziót különbözı eredető, eltérı módon elıkezelt, így különbözı összetételő (más és más xilántartalmú) lignocellulózok enzimes hidrolízisekor. A nyersanyagok között szerepelt keményfa és tőlevelő fa, különbözı mezıgazdasági melléktermékek, illetve egy energianövény (zöld pántlikafő). A nyersanyagok egyetlen kivételtıl eltekintve (nedves oxidációval elıkezelt kukoricaszár) gızrobbantással voltak elıkezelve. A mosott minták (100% sz.a.) szénhidrát koncentrációit a 43. táblázat tartalmazza.
43. táblázat Szubsztrátok elıkezelési körülményei és az elıkezelt, mosott minták összetétele
Szubsztrát Összetétel [a sz.a. tartalom %-ában]
Glükán Xilán Galaktán Arabinán Mannán
Főzfa 195°C-on elıkezelve 54,0 10,00 <0,1 <0,1 2,90
Főzfa 200°C-on elıkezelve 58,7 7,40 <0,1 <0,1 1,10
Főzfa 210°C-on elıkezelve 50,8 3,30 <0,1 <0,1 1,01
Gızrobbantott kukoricaszár 71,8 7,40 0,70 0,20 <0,1
Nedves oxidált kukoricaszár 46,7 14,89 0,39 1,00 <0,1
Gızrobbantott búzaszalma 61,5 3,25 <0,1 0.40 0,12
Gızrobbantott fenyı 56,4 0,12 <0,1 <0,1 0,18
Árpaszalma 190°C-on elıkezelve 63,5 12,10 0,28 0,69 <0,1
Árpaszalma 200°C-on elıkezelve 64,3 5,81 <0,1 0,29 0,14
Zöld pántlikafő 195°C-on 55,2 9,58 0,32 0,77 0,32
Zöld pántlikafő 200°C-on 66,9 5,69 0,16 0,43 0,20
SF 200 93,0 7,00 0,00 0,00 0,00
Minden nyersanyagot egy un. alap celluláz enzimkeverékkel (ACE) hidrolizáltunk, melyben csak cellulózbontó aktivitással rendelkezı enzimkomponensek szerepeltek (xilanáz vagy
hatását a celluláz enzimkeverék kiegészítésével nyert enzimkoktélokkal (ACE+XG;
ACE+XL; ACE+XG+XL) teszteltük. A szubsztrátok teljes szénhidrát tartalmára vonatkoztatott konverziókat (48 óra) adja meg az 44. táblázat.
44. táblázat Alap celluláz enzimkeverék (ACE), valamint különbözı segítı enzimekkel kiegészített celluláz enzimkeverék (ACE+XG; ACE+XL; ACE+XG+XL) hatására 48 órás hidrolízisben elért konverziók. A konverziók az elıkezelt szubsztrát szénhidráttartalmára vonatkoznak
Szubsztrát Konverzió össz-szénhidrát tartalomra vonatkoztatva [%]
ACE ACE+XG ACE+XL ACE+XG+XL
Főzfa 195°C 14,2 13,7 20,6 21,2
Főzfa 200°C 23,3 25,4 29,7 29,1
Főzfa 210°C 37,8 38,1 41,3 40,2
Gızrobbantott kukoricaszár 35,4 34,1 55,6 63,8
Nedves oxidált kukoricaszár 49,1 52,3 67,9 68,9
Gızrobbantott búzaszalma 68,1 69,7 84,9 92,6
Gızrobbantott fenyı 63,2 56,4 72,0 69,5
Árpaszalma 190°C 32,7 39,5 59,6 60,6
Árpaszalma 200°C 58,9 63,2 76,8 79,6
Zöld pántlikafő 195°C 39,4 43,9 59,6 56,9
Zöld pántlikafő 200°C 54,3 58,6 67,0 70,6
SF 200 59,2 59,9 90,7 91,6
A legtöbb xilán polimert a nedves oxidációval elıkezelt kukoricaszár, legkevesebbet a gızrobbantott fenyı tartalmazta. Főzfa esetén 195, 200 és 210°C-on végzett elıkezeléseknél a G/X arány a hımérséklet emelésével nıtt: 5,4; 7,9; és 15,4. Minél erıteljesebb tehát az elıkezelés, annál jobban sérül a hemicellulózok polimer szerkezete, a vízoldható monomerek és oligomerek ugyanis az elıkezelést követı mosással távoznak, így az elıkezelt szubsztrát xilán tartalma csökken, a G/X arány nı.
Xiloglükanáz (XG) kizárólagos használatakor a segítı hatás nem minden nyersanyag esetén érvényesült (195°C-on kezelt főzfa, SPCS és SPS), a nagy maradék xilántartalommal (>9,5%) rendelkezı szubsztrátok esetén a XG adagolásnak a SPW kivételével mindenütt jelentıs pozitív hatása volt (6,5-21%), ez alatt a xilántartalom alatt a hatás nem volt egyértelmő.
A xilanáz (XL), valamint a xilanáz+xiloglükanáz (XL+XG) együttes alkalmazása minden esetben javította a konverziót pusztán cellulázok alkalmazásához képest. A legjelentısebb hatást a SPCS, valamint a 190°C-on gızrobbantottott árpaszalma szubsztát alkalmazásával értünk el (82, ill. 83%), a legkisebbet a SPS esetén, ahol a vizsgált anyagok közül a legkisebb hemicellulóz tartalmat határoztunk meg (43., 44. táblázat). SPW esetén, ahol három különbözı elıkezelési hıfok következtében három különbözı xilántartalmú szubsztátot nyerünk jól követhetı, hogy azonos szubsztráton belül, a xilántartalom emelkedésével nı a segítı enzimek konverziót növelı hatása.
A segítı enzimek (XL+XG) a lignocellulóz hidrolízisben valószínőleg azáltal fejtik ki segítı hatásukat, hogy a cellulóz rostokról eltávolítják az elıkezelés során ott maradt hemicellulóz láncokat. Selig és mtsi. (2008). elıkezelt kukoricaszár hidrolízisében xilanáz és észteráz enzimek adagolásával növelték a cellobiohidrolázok hatékonyságát. A hidrolízisben elért glükán és xilán konverziók abban az esetben voltak a legnagyobbak, ha xilanázt, ferulsav-észterázt és acetil-xilán ferulsav-észterázt tartalmazott az enzimkeverék. A három segítı enzim kis mennyiségben történı adagolása hatékonyabbnak bizonyult (mg hidrolizált glükán/mg felhasznált fehérje), mint a CBH mennyiségének növelése. A cellulázok és segítı enzimek között fellelhetı szinergizmust kihasználva csökkenthetı a hidrolízisben alkalmazott összes enzimfehérje mennyisége, ami a folyamat gazdaságossága szempontjából lényeges.
5.3.2 Különbözı szénforrásokon fermentált celluláz aktivitású fermentlevek és