A celluláztermelést befolyásoló tényezık, enzimlokalizáció, indukció

A Trichoderma reesei egyik legnagyobb hátránya, hogy az általa termelt enzimkomplexben kevés a BGL, ami azt jelenti, hogy a fermentlé felhasználásakor, a hidrolízis során felhalmozódik a cellobióz, mely gátolja az endo- és fıleg az exoglükanázok tevékenységét.

Az elıállított enzimkomplex összetételét és aktivitását több tényezı mellett a fermentáció során beállított pH is befolyásolja, tapasztalataink szerint a nagyobb pH (5,8-6,0) kedvezıbb az extracelluláris BGL termeléséhez. Rázatott lombikos kísérletekben, melyek széles skálájú kísérletezést tesznek lehetıvé egy új nyersanyag, vagy új törzs tesztelésében, komoly gondot okoz a pH állandó értéken tartása a fermentáció során. Különbözı puffer rendszerek alkalmazásával ezt a problémát kívántuk orvosolni. Emellett ebben az alfejezetben ismertetjük az enzimlokalizációra, valamint az enzimindukcióra vonatkozó eredményeinket is.

5.2.2.1 A pH hatása a celluláz és ββββ-glükozidáz termelésre (25. cikk)

Rázatott lombikos kísérletekben SF szénforráson vizsgáltuk különbözı pH állítási stratégiák, valamint citromsav, borostyánkısav, ecetsav, maleinsav adagolás hatását Trichoderma reesei Rut C30 celluláz termelésére. Kísérleteink célja az volt, hogy (i) vizsgáljuk a pH hatását az elérhetı szőrıpapír lebontó és (ii) BGL aktivitásra, másrészt olyan pufferrendszert találjunk, amellyel (iii) a pH állandó értéken tartható és emellett (iv) nem befolyásolja károsan a Trichoderma enzimtermelését. Méréseink során megállapítottuk, hogy az acetát, citrát, szukcinát és citrtát-foszfát puffer nem megfelelı a pH 5,0 állandó értéken tartására, mivel a komponenseik vagy gátolják a mikroba növekedését (acetát), vagy számára tápanyagul

szolgálnak (citrát, citrát-foszfát, szukcinát). Két pufferrendszert találtunk (maleát és trisz-maleát), melyek képesek az állandó pH 6,0 fenntartására (39. táblázat).

39. táblázat FPA és BGL aktivitások alakulása a pH állítás függvényében

pHtervezett pH kontroll módja FPA

(4. nap) Produktivitás

(4. nap) BGL

(7. nap) [FPU/ml] [FPU/lh] [IU/ml]

5,0 napi pH állítás 1,034 10,8 0,6

6,0 napi pH állítás 1,520 15,8 0,9

6,0 0,1 M TRIS-maleát puffer 1,282 13,4 1,5

6,0 0,1 M Maleát-NaOH puffer 1,282 13,4 1,2

SF szénforráson állandó pH 6,0-on lefolytatott fermentációnál 0,1 M-os Tris-maleát puffer alkalmazásakor az FPA 84%-a volt a puffer nélküli, naponta pH állított tenyészetekben elértnek, a BGL aktivitás viszont 67%-kal nagyobb volt, mint a kontroll. Ez az aktivitás arány változás különösen elınyös lehet az enzimes hidrolízisben. Fermentoros kísérleteikben (31 literes Biostat CDCU-3) a pH szabályozásával, pufferek alkalmazása nélkül nem sikerült a várakozásunknak megfelelı hasonlóan nagyobb BGL aktivitást elérni.

Mosatlan gızrobbantott kukoricaszár szénforráson (SPCS II, 210°C, 5 perc) törköly tartalmú táptalajon 0,1 M-os Tris-maleát puffer rendszer alkalmazásával a pH hatását tovább vizsgáltuk, pH 5,0, 5,5 és 6,0-on lefolytatott rázatott lombikos fermentációkban (31. ábra).

FPU/ml CBHI/ml EGI/ml

0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0

BGL/ml

Enzim aktivitás

31. ábra A pH hatása extracelluláris enzimaktivitásokra törköly tartalmú táptalajon SPCS II-n végzett fermentáció 7. napján (0,1 M TRIS-maleát puffer)

(■) pH 5,0; (□) pH 5,5; (■) pH 6,0

Ryu és Mandels (1980) eredményeivel összhangban megállapítottuk, hogy lignocellulóz szubsztrátok esetén a nagyobb pH értékek a kedvezıbbek, mindamellett a pH emelésének

igazán nagy hatása a BGL termelésre volt. Az FPA aktivitás 8 illetve 11%-kal, a BGL 62 illetve 104%-kal nıtt a pH növelés hatására. A CBH I és EG I aktivitásokra a pH változtatása nem volt lényeges hatással.

5.2.2.2 Celluláz termelés vizsgálata szuperkritikus széndioxidos sejtfeltárással (26. cikk)

A Trichodermák által teremelt enzimkomplexben állandó problémát jelent a BGL alacsony szintje. Sejtfeltárási kísérleteinkkel a termelt összes cellulolitikus aktivitás meghatározását kívántuk lehetıvé tenni. A 20 liter hasznos térfogatú laboratóriumi fermentorban (Biostat CDCU-3) SF szénforráson elıállított celluláz tartalmú fermentlé felülúszójából és a feltárt micéliumból FPA és BGL aktivitást határoztunk meg. A sejtek feltárását szuperkritikus CO2 -ban (100 bar, 40°C) hajtottuk végre, a tartózkodási idıt 15 és 60 perc között változtattuk (40. táblázat). Méréseink szerint a feltáráshoz a vizsgált körölmények között 15 perc elégséges.

40. táblázat T. reesei sejtek feltárása szuperkritikus CO2-ban

Tartózkodási idı [perc] FPA aktivitás [FPU/g]

60 7,81

45 8,05

30 7,95

15 8,14

Az intracelluláris és extracelluláris térbıl meghatározott FPA és BGL aktivitásokat a 32. ábra mutatja be.

32. ábra Összenzimtermelés SF szénforráson, extracelluláris (□), intracelluláris (■)

A „teljes”, azaz intra- és extracelluláris enzimaktivitások meghatározásakor az FPA : BGL arány 1 : 1,14-nek adódott, ami azt mutatja, hogy a T. reesei Rut C30 SF szénforráson (pH 5,7-en) megszintetizálja az optimális cellulózhidrolízishez szükséges BGL mennyiséget, de annak mintegy 2/3-a sejtfalhoz kötötten marad, így a felülúszóval végzett hidrolízis során nem hasznosul. Ezt a megállapításunkat támasztják alá Kovács és mtsi. (2009) eredményei, akik összehasonlító hidrolíziseket végeztek T.reesei RutC30 felülúszóval és teljes fermentlével. 48 órás hidrolízisben SPS szubsztráton teljes fermentlé alkalmazásakor 200%-kal nagyobb glükóz koncentrációt értek el a csak felülúszóval végzett hidrolízishez képest.

5.2.2.3 Enzimtermelés indukálásának vizsgálata glükózon növesztett Trichodermával (27. cikk)

Glükóz szénforráson (10 g/l) szaporított T. reesei Rut C30 enzimtermelésének indukálását vizsgáltuk CO2 képzıdés detektálására alkalmas fermentorban. A gomba 24 óra alatt elfogyasztotta az összes glükózt, a CO2 képzıdés erre az idıpontra jelentısen lecsökkent, de csak a 65. órára szőnt meg. A 67. órában történı SF adagolás hatására impulzusszerő CO2

fejlıdés és enzimképzıdés indult meg (33. ábra).

33. ábra A kétlépcsıs ferementáció: FPA aktivitás a fermentlében (—●—) és CO2 koncentráció az elmenı gázban (——)

A kétlépcsıs enzimfermentáció során megfigyelhetı, hogy az impulzusszerő SF beadagolás hatására jelentıs a glükóz képzıdés, s a glükóz koncentráció csak lassan közelíti meg a nullát (34. ábra).

34. ábra A glükóz koncentráció alakulása (—◊—) és az elmenı gáz CO2

koncentrációja a fermentáció második szakaszában

Ennek a kétlépcsıs modellnek akkor lehet gyakorlati jelentısége, amikor az elıkezelés után elválasztott pentóz cukrokat használjuk fel a gomba elszaporítására, majd impulzusszerő cellulóz adagolással biztosítjuk az enzimindukciót. Méréseinkkel igazoltuk, hogy a T. reesei Rut C30 pillanatszerően képes metabolizmusát glükóz hasznosításról cellulóz hasznosítására átkapcsolni. Ez különösen figyelemreméltó Ike és mtsi. (2010) glükóz szénforrás alkalmazásának elınyeit hangsúlyozó munkája tükrében.