A lignocellulózok elıkezelése

A lignocellulózok elıkezelésének értékelésekor elsısorban a kezelés hatására i) elérhetı glükán konverziót (konverzió javulást), ii) a bekövetkezı cellulóz és hemicellulóz elválasztást, valamint iii) cellulóz illetve hemicellulóz veszteséget vizsgáltuk és hasonlítottuk össze.

Kukoricaszár elıkezelésekor a híg kénsavas elıkezelés körülményeinek alkalmas megválasztásával (120°C, 90 perc 2% H2SO4) megoldottuk a hemicellulóz frakciónak a többi polimertıl történı elválasztását - úgy, hogy a cellulóz csaknem 90%-a a szilárd frakcióban maradt - lehetıséget adva ezáltal az öt szénatomos cukrok külön felhasználására (green chemistry, platform chemistry). Megállapítottuk ugyanakkor, hogy a csaknem tökéletes (94%-os) hemicellulóz elválasztás nem eredményezett megfelelı bonthatóság javulást az elıkezelt anyagban (18%-ról 46%-ra változott). Éppen ezért célszerő egy második elıkezelési lépést alkalmazni a cellulóz frakció hidrolizálhatóságának javítása érdekében.

Híg lúgot és híg savat egymás után alkalmazva az elméleti maximumot megközelítı konverzió értéket sikerült elérnünk (96%). A módszer hátránya, hogy nem megoldott a vegyszeres felülúszók hasznosítása. Célszerő a kezelések sorrendjét felcserélni, mert akkor a savas felülúszóból a xilóz, a lúgos felülúszóból a lignin hidrolízis termékei hasznosíthatók.

Mind a gızrobbantás, mind a nedves oxidáció alkalmasnak bizonyult kukoricaszár elıkezelésére, segítségükkel a glükán konverziót három, illetve négyszeresre növeltük a kukoricaszár eredeti enzimes bonthatóságához képest. Ezt gızrobbantásnál 190^oC-on 5 perc reakcióidıvel 2%-os H2SO4-val történı elıáztatással sikerült elérnünk. A nedves oxidáció optimális körülményei 195^oC, 15 perc reakcióidı, 12 bar O2, 2 g/l Na2CO3. A gızrobbantás során 13% volt a cellulóz és 36% a hemicellulóz veszteség, a nedves oxidációnál a cellulóz veszteség mindössze 9%, a hemicellulóz veszteség 40% volt.

A kukoricarostot mind savas (0,9% H2SO4, 120°C, 2 óra), mind lúgos (120°C, 1 óra, 1 és 2%

KOH, illetve NaOH) katalízissel kíválóan sikerült elıkezelnünk (91%, ill. 85-90%-os glükán konverzió). A két módszer közötti lényeges különbség, hogy a savas + enzimes kezelés után a maradékból kukoricarost olajat nyertünk ki jó hatásfokkal (miután annak koncentrációja az eredeti 2%-ról 45%-ra emelkedett a frakcionált mintában), míg a lúgos kezelés után a lúgos elıkezelı oldatból izolált hemicellulózt eredményesen használtuk fel a termoplasztikus keményítı egyes tulajdonságainak javítására. Mikrohullámú reaktorban semleges körülmények között (180°C, 5 perc) a lúgos kezeléssel összemérhetı molekulatömegő hemicellulózt sikerült izolálnunk. Kukorica csíra dara kezdeti 15%-os olajtartalmát többlépcsıs frakcionálással (híg savas és enzimes) 46%-ra növeltük, lehetıvé téve ezáltal préselés alkalmazását a szerves oldószeres extrakció helyett a maradék olaj kinyerésére.

Cukorcirok bagasz gızrobbantásos elıkezelésével 190°C, 10 perc és 200°C, 5 perc reakció körülmények között, elızetes SO2-os impregnálás (0,04 g SO2/g sz.a.) után sikerült 89-92%-os glükán konverziót elérnünk minimális (4 illetve 6%) cellulóz veszteség és 35-40%

hemicellulóz veszteség mellett.

Kender és kenderpozdorja kémiai elıkezelései nem hoztak megfelelı eredményt, valószínőleg a kender kompakt szerkezete következtében.

Kenderkóró és kender szilázs gızrobbantással történı elıkezelésekor a 2% kén-dioxid elıimpregnálást követı 210°C-on 5 perc tartózkodási idı mellett végzett elıkezelés bizonyult a leghatékonyabbnak. Az elıkezelés után meghatározott enzimes bonthatóság kenderkóró esetében 83,1%, a szilázs esetében 89,3% volt, a cellulóz veszteség mindössze 5, illetve 7%, a hemicellulóz veszteség 38 illetve 42% volt. A pentózfrakció elválasztása SPHS esetében jelentısen, 33%-kal javította az SSF hatékonyságát.

Kenderpozdorja gızrobbantásos elıkezelése a legjobbnak talált körülmények között (210°C, 10 perc) 83%-os glükán konverziót eredményezett 11% cellulózveszteség és 70%

hemicellulóz veszteség mellett. Így ez az elıkezelés nem tekinthetı kielégítınek, a továbbiakban vagy katalizátort és rövidebb reakcióidıt, vagy kétlépcsıs elıkezelést kell alkalmazni a hemicellulóz veszteség csökkentése érdekében.

Mindhárom nyersanyagból sikerült etanolt elıállítani gızrobbantás utáni SSF folyamatban:

17,1 g etanol/100 g kender sz.a.; 16,3 g etanol/100 g kenderszilázs sz.a.; 14,1 g etanol/100 g kenderpozdorja sz.a. hozammal.

Balatoni nád nedves oxidációs elıkezelésének hatására az enzimes hidrolizálhatóságot közel négyszeresére emeltük, de a jó bonthatóságot biztosító körülmények alkalmazásakor a cellulóz közel 30%-a elbomlott, a módszer így nem javasolható a balatoni nád elıkezelésére.

Híg kénsavas elıkezeléssel sikerült az energiafő hemicellulóz frakcióját elválasztani, de ez nem eredményezett kielégítı konverzió javulást a maradékban. Mindkét nyersanyagnál meg kell vizsgálni a kétlépcsıs elıkezelés lehetıségét a kisebb veszteség és a jobb enzimes cellulózhidrolízis érdekében.

6.2 Enzimfermentáció

Enzimfermentációs kísérleteink során amellett, hogy Trichoderma reesei Rut C30 enzimtermelését tanulmányoztuk a „lignocellulózból etanol” technológia különbözı köztitermékeinek felhasználásával, foglalkoztunk a pH és az enzimlokalizáció, valamint az indukció kérdésével is. Emellett néhány rekombináns törzs celluláz termelését, valamint jó BGL termelı Aspergillusok szaporítását is vizsgáltuk.

Gızrobbantott főzfa (SPW), ennek ligninmentesített változata és a gızrobbantott főzfa enzimes hidrolízise után kapott nagy lignintartalmú maradék egyaránt jó szénforrásnak bizonyult T. reesei Rut C30 fermentációjához. A gızrobbantással történı elıkezelés során keletkezı zagy elválasztásával nyert folyadékfrakció (hemicellulóz hidrolizátum, pentózfrakció) bepárlásával nyert sőrítményt, mely az élesztık számára toxikusnak bizonyult, a T. reesei Rut C30 szénforrásként tudta hasznosítani, úgy, hogy az ecetsavat elfogyasztotta és a ligninbıl származó fenolos inhibitorok koncentrációját jelentıs mértékben (30%) csökkentette. Amellett, hogy az általunk elsıként alkalmazott biológiai detoxifikálás hatásosnak bizonyult az inhibitorok koncentrációjának csökkentésére, alternatív felhasználási lehetıséget nyújtott a pentóz cukrok hasznosítására. A tizedére besőrített pentózfrakció felhasználásával a fermentáció szénforrása (SPW) 50%-ban volt helyettesíthetı, a hozam közel 30%-os növekedése mellett. A sőrítetlen pentóz frakció csak korlátozottan volt alkalmas enzimfermentáció szénforrásának, a SPW 20%-át az alkalmazott pH-tól és a keveréstıl függetlenül helyettesíthettük vele; 50%-ban történı alkalmazásakor csak a pH 6,0-on lefuttatott kísérlet volt sikeres (300 fordulat/perc rázatás), alacsonyabb pH-n, vagy kisebb rázatási fordulatszánmál nem volt enzimtermelés. A 80%-ban a pentóz frakcióból származó szénforrás semmilyen körülmények között nem volt alkalmas a gomba szaporításához, valószínő, hogy az inhibitorok együttes hatása volt toxikus.

Gızrobbantott lucfenyı felhasználásával is sikerült celluláz enzimet termelnünk mosott rostfrakción és olyan táptalajon is, ahol a szénforrás 50%-át a hemicellulóz frakcióból biztosítottuk. A legnagyobb celluláz enzimaktivitást (0,79 FPU/ml) a mosott rost szénforrás alkalmazásával, a legkisebbet az 50%-ban hemicellulóz hidrolizátumból származó szénhidrátot tartalmazó táptalajon értük el.

Hullámpapír hulladékot és papíriszapot is sikeresen használtunk enzimfermentáció szénforrásaként, az elıállított enzimet nyúltáp kezelésére használtuk. Gızrobbantással elıkezelt kukoricaszár és laktóz alkalmasak a SF helyettesítésére, laktóz szénforrás alkalmazásakor a BGL aktivitás kétszerese, az FPA viszont csak fele volt a SF-on elértnek.

Nedves oxidációval elıkezelt kukoricaszár hemicellulóz hidrolizátuma alkalmas a fermentáció során a víz 75%-ban történı helyettesítésére. Alk-185-5 elıkezeléssel nyert HH alkalmazása esetén a térfogati aktivitás csaknem 40%-kal, a hozam pedig 10%-kal volt jobb, mint a kontrollnál.

Rázatott lombikos kísérletek során gondot okozó naponkénti pH állítás kiküszöbölése érdekében lefolytatott pH állítási kísérleteink sikeresek voltak, s találtunk két alkalmazható puffer rendszert a pH stabilizálására. 6,0-os pH-n a maleát és trisz-maleát puffer rendszer is alkalmas volt a rázatott tenyészetek pH-jának állandó értéken tartására. A 0,1 M-os trisz-maleát puffer alkalmazásakor a BGL aktivitás 30-50%-kal nagyobbnak adódott, mint a nem pufferolt rendszerekben.

Solka Floc szénforráson a T. reesei Rut C30 teljes enzimtermelése, azaz az intra- és az extracelluláris aktivitások összessége (szuperkritikus CO2-ban feltárva, 100 bar, 40°C, 15 perc) kiegyensúlyozott volt. A gomba a hatékony enzimes hidrolízishez elegendı BGL-t

szintetizált, viszont az csak 35%-ban jelent meg oldottan a fermentlében, a fermentlé felülúszó az enzimes hidrolízisben alkalmazva, így BGL deficitesnek bizonyult.

T. reesei Rut C30 növekedési dinamikájának vizsgálatakor megállapítottuk, hogy pillanatszerően képes metabolizmusát glükóz hasznosításról cellulóz hasznosítására átkapcsolni, mellyel együttjár az intenzív celluláztermelés. Ennek a kétlépcsıs technikának akkor lehet gyakorlati jelentısége, amikor az elıkezelés után elválasztott pentóz cukrokat használjuk fel a gomba szaporítására, majd impulzusszerő cellulóz adagolással biztosítjuk az enzim termelés indukciót.

Genetikailag módosított T. reesei QM9414 törzsekkel rázatott lombikos fermentációban T. reesei teljes Cel7B endoglükanázt, ill. Cel7B katalitikus alegységet jó hozammal tudtunk szelektíven elıállítani. T. reesei QM9414 Cel7B-t termelı mutánsának rátáplálásos fermentációjában megnövelt szervetlen N-tartalomnál az enzim mellett nagy mennyiségben szintetizálódott egy kis moltömegő fehérje, melyet szerin proteáznak azonosítottunk. Ennek jelenlétével magyarázható, hogy a rekombináns törzzsel a megnövelt N-tartalom alkalmazásakor csak a CBD nélküli Cel7B-t tudtuk elıállítani.

Thermoascus aurantiacus heterológ CBH I termelését, fermentálhatóságát és stabilitását a Trichoderma reesei Rut C30 szaporításával megegyezı körülmények között vizsgáltuk, így lehetıség nyílt a szülı és a módosított törzs a T. reesei RF6026 összehasonlítására. SF, laktóz, gızrobbantott kukoricaszár szénforráson a két törzs enzimtermelése FPA, BGL és EG aktivitások tekintetében megegyezett. A heterológ CBH I enzimtermelés sikerességét a 70°C-on végzett enzimaktivitás méréssel igazoltuk.

Optimalizált körülmények között végrehajtott glutáraldehides kezeléssel sikerült jelentısen megnövelni a BGL tartalmú mikrobiális pelletek stabilitását. Tíz egymást követı hidrolízis (2196 óra) során a kezdeti hidrolízis sebesség nem csökkent szignifikánsan. A Trichodermákkal ellentétben az Aspergillusok mindenféle megkötés nélkül jól növekedtek a SPW eredető hemicellulóz hidrolizátum szénforráson, a BGL termelés meghaladta a kontroll szénforráson (glükóz) elért értékeket. Aspergillus niger BGL tartalmú fermentlevének felülúszóját polietilén-glikol (PEG)-dextrán vizes kétfázisú rendszerben 700-szorosra sikerült töményítenünk. A BGL visszanyerése 85-95%, a tisztulása 2-3-szoros volt.