5 EREDMÉNYEK ÉS KÖVETKEZTETÉSEK
5.1 Lignocellulózok elıkezelése, frakcionálása
5.1.2 Kukoricarost frakcionálása
A kukoricakeményítı gyártási technológia során mintegy 10%-nyi rost keletkezik (6. ábra), melyet jelenleg állati takarmányként (CGF takarmány), illetve tüzipelletként hasznosítanak az áztatóvíz, a fehérje frakció és a besőrített desztillációs maradék együttes felhasználásával. Egy Széchenyi pályázat keretében (NKFP-OM-00231/2001) alternatív felhasználási módokat kerestünk a napi 300 t rost hasznosítására. A kukoricarost a maradék keményítın kívül jelentıs mennyiségő hemicellulózt (fıként xilánt) és cellulózt, valamint kisebb mennyiségben lignint, olajat, fehérjét és szervetlen hamualkotókat is tartalmaz. Frakcionálási célunk az volt, hogy úgy tegyük a cellulóz frakciót az enzimes hidrolízisre, illetve fermentációs szénforrásnak alkalmassá, hogy közben értékes termékeket nyerjünk. A kukoricarost frakcionálását (elıkezelését) vizsgáltuk savas, lúgos, valamint mikrohullámú kezeléssel (semleges körülmények között). Valamennyi kísérletünket amilolitikus enzimekkel keményítı mentesített darálatlan rosttal végeztük (8-10 mm).
5.1.2.1 Kukoricarost elıkezelése, lúgos és mikrohullámú frakcionálása (5., 6., 7., 8. cikk)
A natív kukoricaroston végzett kísérletek a 10. ábrán láthatók.
Kukorica rost (CF) (légszáraz, nem darált)
Keményítı mentes rost (DCF)
(légszáraz, nem darált) Keményítı hidrolízistermékeit tartalmazó felülúszó Keményítı bontás (α-amilázzal)
és szőrés
Lúgos elıkezelés (1óra 120°C-on 2 bar nyomáson), centrifugálás
Etanol fermentáció (lehetıség)
Elıkezelt rost (PCF) (légszáraz)
Szimultán enzimes hidrolízis és alkoholfermentáció S. cerevisiae
élesztıvel
Etanol
Hemicellulóz-B Hemicellulóz-B tartalmú felülúszó
pH állítás majd alkoholos csapadékképzés
10. ábra A kukoricarost frakcionálásának lépései
A kezelt és kezeletlen kukoricarost minták szénhidrát összetételét a 19. táblázat tartalmazza.
19. táblázat CF, DCF, illetve lúgosan elıkezelt kukoricarost minták szénhidrát összetétele (a sz.a. %-ában)
Elıkezelések / minták Glükán Xilán Arabinán
[%] [%] [%]
Kukoricarost (CF) 30,3 21,3 11,7
Keményítımentes rost (DCF) 18,8 26,4 15,0
1% KOH 44,7 23,3 11,3
2% KOH 45,3 23,5 11,5
1% NaOH 46,4 23,3 11,2
2% NaOH 45,2 20,9 10,0
A keményítı eltávolításával a kukoricarost glükán tartalma 30,3%-ról 18,8%-ra csökkent, utóbbi érték a DCF cellulóz tartalmának tulajdonítható. Mivel a többi komponens nem oldódott ki a rostból, így ezek relatív mennyisége a DCF mintában nıtt. A lúgos kezelések hatására a hemicellulóz és lignin részben kioldódott, s ezzel egyidejőleg a glükán tartalom jelentısen emelkedett (46,4%).
Az elıkezelt rostokat SSF kísérletekben (S 5%, 25 FPU/g cellulóz, 37°C, 48 h) vizsgáltuk, eredményeinket a 20. táblázat tartalmazza.
20. táblázat Etanolfermentáció elıkezelt kukoricarost és SF kontroll szubsztráton
Etanol Yethanol
[g/l] [%]
SF 7,4 53,6
DCF 1,3 24,1
1% KOH kezelt rost 12,5 96,9
2% KOH kezelt rost 11,6 89,9
1% NaOH kezelt rost 12,3 91,8
2% NaOH kezelt rost 12,0 94,5
Valamennyi elıkezelés kiválónak bizonyult, a glükán koncentrációra számított elméleti etanolhozam 90-97%-át értük el, a DCF 24,1 és a SF 53,6%-ával szemben. A lúgos kezelések hatására oldatba ment hemicellulóz mennyiségek a 11. ábrán láthatók.
83,50 87,70 84,80 88,00 0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
1% KOH elıkezelt
2% KOH elıkezelt
1% NaOH elıkezelt
2% NaOH elıkezelt
Hemicellulóz kioldás (%)
11. ábra Az elıkezelések során a kukoricarostból a felülúszóba kioldódott hemicellulóz mennyisége
Miután a kukoricarost hemicellulóz tartalmának 83-88%-a oldatba ment, az elıkezelés nemcsak a cellulóz szerkezet fellazítására, de a két poliszacharid frakció meglehetısen jó elválasztására is alkalmas. Erre alapoztuk a hemicellulóz izolálására vonatkozó kísérleteinket, amikoris a keményítımentes kukoricarostot 2,5%-os NaOH-dal illetve 2,5%-os NaOH + 0,6%-os H2O2-dal kezeltük hat különbözı kísérleti beállítás mellett, hogy ilymódon polimer formában izoláljuk a hemicellulózt. 120 perces kezeléssel 80-85%-os kinyerést értünk el. A peroxidos NaOH valamennyi esetben néhány %-kal javította a kihozatalt. A fázisok analízise szerint a glükán 53-60%-a, a hemicellulóz 7-15%-a maradt a szilárd fázisban.
A legjobb kihozatalt (83,5%) a legerélyesebb körülmények között végrehajtott kezeléssel értük el (2,5%-os NaOH + 0,6%-os H2O2, 120°C, 120 perc). A polimer frakciót (CFG) etanolos kicsapással (pH 4,5, 2-szeres tf. etanol) 51,3%-os hatásfokkal nyertük ki a kukoricarost eredeti hemicellulóz tartalmára vonatkoztatva (12. ábra).
12. ábra Az alkoholos kicsapással nyert hemicellulóz-B kihozatalok
A szilárd maradékot, mely a szénhidrátok mellett kevés lignint, rostolajat és fehérjét is tartalmazott, mind enzimes hidrolízis szubsztrátjaként (90% feletti glükán konverzió, részletes adatok: Gáspár és mtsi., 2005), mind celluláz enzimfermentáció szénforrásaként (13. ábra) sikeresen használtuk fel (5 g/l szénhidrát+ Mandels’ sók, T.reesei Rut C30, 5 nap).
13. ábra Elıkezelt (PCF) mintán, kukoricaroston (CF), keményítı mentes roston (DCF) és SF-on elért szőrıpapír bontó aktivitások (FPA) 5 napos fermentáció után
A 21. táblázat néhány korábbi eredményünkkel hasonlítja össze a PCF és SF szénforrásokon elért FPA és BGL hozamokat.
21. táblázat Az elıkezelt kukorica roston (PCF) és SF-on elért eredmények összehasonlítása más lignocellulózokon elért enzimhozamokkal
Szénforrás FPA hozam BGL hozam
[FPU/g szénforrás] [IU/g szénforrás]
PCF 122 56
Solka Floc (SF) 146 102
Papíriszap1 75 30
Gızrobbantott fenyı1 64 30
Gızrobbantott főzfa1 139 51
1Bollók és mtsi. (2000)
A kinyert CFG mintákat termoplasztikus keményítı (TPS) tulajdonságainak javítására használtuk fel cellulózzal és a kukoricából izolált zein fehérjefrakcióval együtt, ezeket az eredményeket az 5.5.3 fejezet tartalmazza.
Keményítı-mentesített kukoricarostból katalizátor nélkül, semleges pH-n végrehajtott mikrohullámú kezeléssel is sikerült hemicellulózt izoláltunk. A kezelési hımérséklet függvényében vizsgáltuk a hemicellulóz kinyerés hatásfokát és az izolált poliszacharid molekulatömegét. A 14. ábrán a 180 és 210°C-on mikrohullámmal extrahált hemicellulóz minták méretkizárásos (SEC) RI kromatogramjai láthatók.
14. ábra 180 (―) és 210°C-on (– –) mikrohullámmal extrahált hemicellulóz minták méretkizárásos RI kromatogramjai
Az izolátumok méretkizárásos kromatogramjain látszik, hogy 180°C-on két jól definiálható csúcs van. Ezek közül az elsı a nagy molekulatömegő frakciót jelzi, a második a kisebb
fragmentumokét. Elıbbi területe lényegesen nagyobb, mint a második csúcsé. Ezzel szemben a 210°C-on izolált frakció négy csúcsot mutat, a csúcsok a kisebb molekulaméret irányába vannak eltolódva, és szélesebb, elmosódottabb a haranggörbe, ez jelzi a kisebb, sokféle mérető oligomer fragmentumok jelenlétét. A hemicellulóz kihozatalt növelni tudtuk a reakció hımérséklet emelésével (15. ábra), de ez az izolált hemicellulóz molekulatömegének jelentıs csökkenésével járt együtt. 160°C-on a nyersanyagban levı xilánnak 10%-át sikerült izolálnunk, melynek átlagos molekulatömege 1,37x105 g/mol volt. A reakció hımérsékletét 210°C-ra növelve a hemicellulóz 30%-át nyertük ki a rostból, de a molekulatömege
150 160 170 180 190 200 210 220 Hımérséklet (°C)
15. ábra Hımérséklet hatása a mikrohullámmal extrahált hemicellulóz hozamára (●) és molekula tömegére (□)
5.1.2.2 Kukoricarost és kukoricacsíra dara hígsavas frakcionálása (9., 10., 11. cikk)
A keményítı-mentesített kukoricarostot híg kénsavas hidrolízisnek is alávetettük azzal a céllal, hogy a hemicellulóz frakciót hidrolizált formában (monomerként) nyerjük ki és válasszuk el a rost többi komponensétıl.
A 22. táblázat az elıkezelı kénsav koncentrációjának függvényében mutatja be a fıbb komponensek tömegének alakulását az elıkezelt rostban.
0,9%-os kénsavas kezeléssel (120°C-on, 2 órás reakcióidıvel) a kukoricarost hemicellulóz frakciójának 99%-át sikerült oldatba vinnünk. Ezalatt a cellulóz 85%-a a fehérje egy részével, a ligninnel és a rostolajjal együtt a szilárd frakcióban maradt. A hemicellulóz eltávolítása kíváló elıkezelést eredményezett, mert a maradék rostanyagot a szokásosnál jelentısen kisebb enzimdózis alkalmazásával (5 FPU/g sz.a.+5 IU BGL/g sz.a.) 91%-os konverzióval sikerült hidrolizálni (50°C, pH 4,8, 48 órás reakcióidı). Az enzimes hidrolízis után visszamaradó szilárd fázis két frakcióra volt elválasztható, a finom rost (10,8 g) tartalmazta a maradék fehérjét (4,1 g) és az olajat (4,6 g), a durva rost (1,9 g) a maradék cellulózt (0,7 g).
22. táblázat Keményítımentesített kukoricarost (DCF) híg kénsavas kezelése során nyert
A híg kénsavas elıkezelés és enzimes hidrolízis után olyan maradékanyagot kaptunk (finom rost), melyben a maghéjban eredetileg csak 2-3%-ban jelenlevı, s így onnan gazdaságosan nem kinyerhetı maghéj olaj 45,5%-ra dúsult. Ezáltal megteremtettük annak a lehetıségét, hogy ezt az értékes olajat a kukoricamaghéjból kinyerjük. Emellett a frakcionálás során a következı érdekes jelenségre is figyelmesek lettünk: a maghéj eredeti analízisekor meghatározott 2 g extrahálható olaj helyett a keményítı, a hemicellulóz és a cellulóz eltávolítása után visszamaradó un. finom rost frakcióban 4,6 g extrahálható olajat tudtunk meghatározni a kukoricarost (CF) eredeti 100 g-jára vonatkoztatva. Ez a látszólagos rostolaj mennyiség növekedés valószínőleg a pericarp rétegben eredetileg kötött állapotban, a lipo-poliszacharidokban és a lipoproteinekben lévı lipidek felszabadulásának tudható be. A kötött állapotban lévı lipidek felszabadulásával párhuzamosan olyan szterinek és szterinészterek is extrahálhatóvá váltak, amelyek a maghéj közvetlen extrahálásával nem voltak kinyerhetık. A frakcionálás végén kinyert olaj szterin összetétele szignifikánsan különbözött a kukorica csíraolajétól. A frakcionálás végén kinyert olajból a további felhasználásra, pl. funkcionális élelmiszerek elıállítása céljából a szterineket, szterinésztereket tisztán ki lehet nyerni.
A kukoricacsíra olaj (mely a kukoricakeményítı gyártás ikerterméke) préselési maradéka a kukoricacsíra dara, melyet jelenleg takarmánykészítésnél használnak fel. Frakcionálásával, a kukoricarostnál kidolgozott biofinomítási koncepció alapján, értékes, egyéb célokra alkalmas anyagokat kívántunk nyerni, de a kukoricarosttól eltérıen, nem értünk el éles szétválasztást az egyes komponensek között. A kezelés ezzel együtt hasznos volt, mert a szilárd maradékban meghatározott 15% olajtartalom a kezelések hatására 46%-ra emelkedett, mely lehetıvé teszi, hogy a kukoricacsíra olaj maradékot egy második préselési lépéssel (és ne oldószeres extrakcióval) nyerhessük ki a darából. A kezelés során elválasztott folyadékfázis glükóz, xilóz illetve arabinóz tartalma fermentációs, vagy kémiai módszerekkel tovább alakítható (részletes eredmények: Kálmán és Réczey, 2008).
A kukoricarost frakcionálását mind lúgos, mind savas elıkezelés segítségével sikeresen oldottuk meg. A lúgos kezelésnél a hemicellulózt polimer formában (CFG) kinyerve TPS egyes tulajdonságainak javítására használtuk fel, míg a maradék rostot (PCF) enzimfermentáció szénforrásaként és etanolfermentáció szubsztrátjaként hasznosítottuk. A kukoricarost híg kénsavas elıkezelésével a hemicellulóz frakciót 99%-ban sikerült elválasztanunk a szilárd maradéktól, úgy, hogy a cellulóz 87%-a a szilárd maradékban
maradt. A pentóz cukrok hasznosítása különbözı eljárásokban lehetséges, fermentációban xilitté (Rao és mtsi., 2006), vagy etanollá (Grohman és Bothast, 1997), esetleg astaxanthinná (Nghiem és mtsi., 2009) alakítható. A savasan elıkezelt szilárd rostot egészen kis enzimdózissal (5 FPU/g sz.a.) 91%-os konverzióval hidrolizáltuk, s a maradékból sikeresen nyertük ki a kukoricarost olajat (4,6 g/100 g eredeti rost), mely élettani hatását tekintve még a kukoricacsíra olajnál is kedvezıbb. A savas elıkezelést és a szétválasztott frakciók hasznosítását a kisebb savkoncentrációk irányában érdemes tovább vizsgálni, a savkoncentráció csökkentésével (0,5%) ugyanis a szilárd fázisban maradó cellulóz mennyisége akár 96%-ra is emelhetı, úgy hogy a hemicellulóz 97%-a továbbra is kioldható marad.