Integrált fruktooligoszacharid-szintézis és glükóz-eltávolítás megvalósítása.88

A kialakított rögzített biokatalizátorok alkalmazásával egy, a termék-elıállítást és melléktermék-eltávolítást szimultán megvalósítani képes, laboratóriumi mérető, integrált reaktorrendszert állítottam össze és vizsgáltam a fruktooligoszacharidok elıállításának lehetıségét az egyidejőleg megvalósított glükóz oxidáció mellett.

4.5.1. Integrált rendszerő reaktorkísérletek

Amint azt a 2.4.1. fejezetben leírtam, a fruktooligoszacharidok biokatalitikus szintézisénél a melléktermék glükóz okozta kompetitív gátlás hatásának csökkentése céljából már néhány évvel ezelıtt is alkalmazták a glükóz-oxidációt, a melléktermék eliminálására [SHEU és mtsai, 2001]. Levegıztetett kevert tankban, oldott enzimek elegyét alkalmazták, és jelentıs javulást értek el a produktivitás tekintetében a glükóz-oxidáció nélküli rendszerhez képest. Az alkalmazott készülék végeredményben egy integrált rendszer volt, hiszen a primer folyamat, a fruktooligoszacharidok szintézise szimultán zajlott a szekunder glükóz-eliminációs folyamattal.

Munkámban hasonló rendszert valósítottam meg, de rögzített enzimekkel, így ki tudtam használni az immobilizálás elınyeit. A három fázis jelenléte miatt és az enzimek eltérı hıfok-optimumaihoz való alkalmazkodás érdekében kétreaktoros, ciklikus mőködéső

megoldást választottam. Az integrált rendszer összeállítása során két laboratóriumi mérető oszlopreaktort kapcsoltam össze, amelyek a 4.4.2. fejezetben már ismertetett, a glükóz-oxidáció vizsgálatánál alkalmazott egységgel azonos paraméterekkel rendelkeztek. Az oxigén bevitelét az ott alkalmazott szilikoncsı betét beépítése nélkül, az oxigén egyszerő bebuborékoltatásával oldottam meg. A szilikoncsı betétet azért nem használtam, mert az oxigénbeviteli kísérletek (4.4.2.1. fejezet) eredményei alapján várható volt, hogy a csövön keresztüli oxigénbevitel kis sebessége nagymértékben visszafogná a kapcsolódó enzimkatalizált folyamat, a glükóz-oxidáció sebességét és ebbıl következıen a fruktooligoszacharid szintézis sebessége is jelentısen elmaradna attól az értéktıl, amit a bemért fruktozil-transzferáz aktivitás lehetıvé tenne.

Az integrált reaktorrendszer összeállítási és mőködési vázlata a 31. ábrán látható.

A fruktooligoszacharidok elıállítására szolgáló reaktoregységet 53 °C-ra termosztáltam, míg a glükóz eltávolítására szolgáló egységet 25°C-on mőködtettem, azaz mindkét enzim a hıfok-optimumán mőködött. A kísérlet során a két reaktorban ciklikusan folytattam a reakciókat, a fruktooligoszacharidok szintézisét, illetve a glükóz oxidációját - a reakcióelegyet minden ciklus végén kicserélve a két oszlop között, így biztosítva a félfolyamatos termék-elıállítást, valamint a szimultán melléktermék-eltávolítást a rendszerben. Ciklusidınek 2 órát választottam, mert ennyi idı alatt keletkezett olyan koncentrációjú glükóz, amely még nem okozott jelentıs inhibíciót.

Az ábrán látható ciklus (az n-edik ciklus, n ≠ 1, 2) szerinti mőködéskor a bal oldali reaktor rögzített Pectinex Ultra SP-L töltetet tartalmazott, és állóágyas üzemben mőködött, a folyadékfázis recirkulációja mellett. A reaktoron keresztül, felülrıl lefelé cirkuláltatta a perisztaltikus pumpa a reakcióelegyet, az 1., 5. és 6. szelepek nyitott állása mellett. A 2.,3., 4., 7.és 8. szelep értelemszerően zárva volt.

Ezzel szimultán módon a jobb oldali reaktorban glükóz-oxidáció folyt. A 9. szelepen keresztül beadagolt, és a perforált lemez által eloszlatott oxigén keverte el a reakcióelegy teljes tömegében a katalizátor szemcséket. A 8. szelep zárva volt.

A ciklus végén megcseréltem a folyadékfázisokat az oszlopokban. A bal oldali oszlopból, megfordítva a perisztaltikus pumpa irányát, a perforált lemezen keresztül áramoltattam a folyadékot – az 1., 7. és 10. (nyomáskiegyenlítı) szelep nyitott állása

szelepet lezárva, majd az 1.. 6., és 8. szelepeket nyitva adagoltam a pumpával a ciklusban glükóz-oxidáción átment folyadékot a bal oldali kolonnába (2. ütem). A csere 3. ütemében a tartályban lévı folyadék került a pumpa segítségével a glükóz-oxidációs oszlopba, úgy, hogy elıbb zártam az 1., 3., 6. és 8. szelepeket, majd nyitottam a 2. és 4. szelepet.

31. ábra: Fruktooligoszacharidok szintézisének vizsgálatára szolgáló integrált reaktorrendszer összeállítása

Kiindulási állapotként (1. ciklus) az 1. reaktorba 10 g rögzített Pectinex Ultra SP-L biokatalizátort, valamint 130 cm³ 2 M szacharóz szubsztrátot (pH=5,6, 0,05 M acetát

puffer) töltöttem. A pH=5,6 érték kiválasztásánál a fruktooligoszacharidok elıállítására alkalmas immobilizált biokatalizátor elızetesen megállapított (4.1.2.2. fejezet) mőködési pH-optimumát vettem alapul, mivel a koimmobilizált glükóz-eltávolításra alkalmas enzimkészítmény mőködési pH-optimuma 5,1, tehát a két érték között nincs jelentıs különbség. A 2. reaktorban 5 g koimmobilizált glükóz-oxidáz – katalázt helyeztem el, viszont a kiindulási ciklusban itt nem volt szubsztrát, hiszen ekkor glükóz eltávolítására még nem volt szükség.

A 2. ciklusban az 1. reaktorból a folyadékot átvezettem a 2. oszlopra, az 1. oszlopra pedig 130 cm³ mennyiségő friss 2 M szacharóz szubsztrátot (pH=5,6, 0,05 M acetát puffer) adagoltam. Így tulajdonképpen kétféle reakció (I. és II.) folyt a két reaktorban, a reakcióelegyek ciklikus cseréjével. A ciklusok mőködtetését mindaddig folytattam, amíg megfelelıen magas fruktooligoszacharid-koncentrációt el nem értem. Az egyes ciklusok végén mindkét elegyben mértem a keletkezı, illetve a maradék glükóz mennyiségét (20.

táblázat).

20. táblázat: Az integrált rendszer egységeiben, adott ciklusok végén mérhetı glükóz-koncentrációk alakulása

I. II.

1. reaktor 2. reaktor 1. reaktor 2. reaktor ciklusok glükóz koncentráció (mg cm^-3) glükóz koncentráció (mg cm^-3)

1 20,33 - 19,23 -

2 22,41 0,14 23,62 0,54

5 24,32 1,89 22,61 2,12

10 35,33 2,33 41,74 3,66

A kísérletsorozat végén meghatároztam a két szubsztrát-áramban a fogyott szacharóz és a keletkezett fruktooligoszacharidok mennyiségét. Az eredményeket a 21. táblázatban foglaltam össze, melybıl látható, hogy az alkalmazott idı, illetve ciklusszám mellett 70 % feletti termékhozamot sikerült elérni, amely lényegesen magasabb, mint a korábban, melléktermék eltávolítása nélkül elért érték. Ez az eredmény megközelíti a mechanikusan

kevert reaktorban, a kétféle immobilizált enzim keverékével elért oligoszacharid hozamot [SHEU és mtsai, 2001].

21. táblázat: Integrált rendszer eredményei

I. II.

GF

(mg cm^-3) 67,00 75,23

GF2

(mg cm^-3) 245,36 237,98

GF3

(mg cm^-3) 181,23 169,47

GF4

(mg cm^-3) 82,58 75,36

Hozam

(%) 74,44 70,59

Az eredményeimbıl látszik, hogy a két – a szintézist katalizáló enzimet, illetve a melléktermék eliminációt katalizáló enzimet tartalmazó – a reaktorból és a szükséges segédberendezésekbıl álló ciklikus integrált rendszert érdemes tovább vizsgálni, a ciklusonkénti folyadékcserékhez szükséges megfelelı automatikával ellátni, majd mőködését összehasonlítani más típusú fruktooligoszacharid elıállítására szolgáló integrált berendezésekkel. Az összehasonlító vizsgálatok alapján lehet dönteni arról, hogy érdemes-e a reaktorrendszert méretnövelni.