Az enzimaktivitások meghatározása

Munkám során a fruktozil-transzferáz aktivitás és a glükóz-oxidáz aktivitás meghatározásakor mindkét esetben adott körülmények között (3.2.1.1. és 3.2.1.2. fejezet) képzıdı glükóz mennyiségének meghatározását végeztem el, azonban a két enzim esetében két különbözı módszerrel.

A fruktozil-transzferáz aktivitás meghatározására azért választottam az o-dianizidin-módszert, mert ez szelektív a glükózra. Az aktivitás meghatározása során pedig - az egyéb zavaró tényezık, úgymint a fruktooligoszacharidok és a fruktóz hatásának kiküszöbölésével - csak a keletkezı glükóz mennyiségének meghatározására volt szükségem.

Ugyanakkor a glükóz-oxidáz aktivitás meghatározása során nem alkalmazhattam az o-dianizidin-módszert, mivel az szintén glükóz-oxidáz enzim mőködésén alapul, így kivitelezése során H2O2 keletkezésével is számolni kell, amely alkalmatlanná teszi a módszert ebben az esetben. Éppen ezért kellett egy másik, glükóz-koncentráció meghatározására alkalmas mérési eljárást találnom, ez pedig az o-toluidin módszer volt, amely mellesleg technikai szempontból is lényegesen egyszerőbben kivitelezhetınek bizonyult.

Kísérleteim eredményességét az enzimkészítmények aktivitásának mérésével követtem nyomon, melyet oldott állapotú biokatalizátornál U cm^-3, immobilizált enzimnél U g^-1 hordozó mértékegységben adtam meg.

3.2.1.1. Fruktozil-transzferáz aktivitásának mérési módszere

Az enzimek fruktozil-transzferáz aktivitását a szintézisreakció során melléktermékként keletkezı glükóz (G) mennyiségével jellemeztem [YUN, 1996]: 1 U azt az enzimmennyiséget jelöli, amely 1 µmol glükózt képez percenként.

Az oldott állapotú biokatalizátor aktivitásának megállapítása során 0,5 cm³ Pectinex Ultra SP-L enzimkészítményhez 1,5 cm³ 2 M szacharóz oldatot (pH=5,6, 0,05 M acetát

puffer) mértem, fél óra reakcióidı és 150 rpm mellett történı rázatás után az oldatot kiforraltam és meghatároztam az abban keletkezı glükóz mennyiségét.

A rögzített enzimkészítmény esetében az aktivitások értékét a 2 M kiindulási szacharóz-koncentrációval rendelkezı oldatban (pH=5,6, 0,05 M acetát puffer) 200 mg rögzített biokatalizátor hatására, 53°C-on, 150 rpm rázatás mellett 2 h alatt keletkezı glükóz mennyiségének meghatározásával állapítottam meg.

A glükóz mennyiségének meghatározása fotometriás módszer segítségével történt, o-dianizidin reagens felhasználásával (SIGMA) [SIGMABULLETIN]. Ez az enzimatikus módszer glükóz-oxidáz és peroxidáz enzimek együttes mőködésén alapul.

A kétlépéses folyamat elsı lépéseként (lásd 8.) β-D-glükóz glükóz-oxidáz (GOD) enzim hatására oxidálódik D-glükonsavvá és hidrogén-peroxiddá. A második lépésben (lásd 9.) a keletkezett H2O2 hatására az o-dianizidin színreagens oxidálódik, melynek következtében piros szín alakul ki a reakcióelegyben, így 500 nm-en fotometrálhatóvá válik.

A módszer leírása:

Felhasznált reagensek:

Reagens A: Na-acetát puffer, pH=5,1

A reagens elkészítése során 2,84 cm³ 99%-os ecetsavat kell kb. 900 ml desztillált vízzel hígítani, majd az oldat pH-ját 30 %-os NaOH oldat adagolásával pH=5,1-re állítani. A kapott oldatot 1000 cm³-re kell hígítani desztillált vízzel.

Reagens B: o-dianizidin reagens (0,21 mM)

A reagens elkészítéséhez 13,2 mg o-dianizidint 2 cm³ desztillált vízben kell feloldani, majd 200 cm³-re hígítani Reagens A-val.

Reagens C: peroxidáz oldat

Reagens D: glükóz-oxidáz oldat

A reagens 0,5 U cm^-3 glükóz-oxidáz aktivitású oldat Reagens A-ban elkészítve.

A glükóz koncentrációjának meghatározása során a komponenseket a következı mennyiségekben és sorrendben kell összemérni: 2,4 cm³ Reagens B + 0,5 cm³ minta + 0,1 cm³ Reagens C + 0,1 cm³ Reagens D. Az ebben a reakcióelegyben kialakuló színváltozás fél óra várakozás után fotometrálható. A módszer 0 és 4 mg cm^-3 glükózkoncentráció-tartományban megbízhatóan alkalmazható.

y = 3,341x - 0,0445 R² = 0,9996

0 0,5 1 1,5

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

glükózkonc. (mgcm^-3)

ABS

9. ábra: Kalibráló görbe a glükóz-koncentráció o-dianizidin-módszerrel történı spektrofotometriás meghatározásához

3.2.1.2. Glükóz-oxidáz aktivitásának mérési módszere

Az alkalmazott glükóz-oxidáz (FLUKA) enzim aktivitása a következıképp jellemezhetı: 1 U aktivitású az a glükóz-oxidáz mennyiség, amely egy perc alatt pH=5,1 és 25°C-on 1 µmol β-D-glükóz oxidációjára képes [BLANDINO és mtsai, 2001].

Az oldott állapotú enzim glükóz-oxidáz aktivitásának meghatározása során 10 cm³, 10 mg cm^-3 kiindulási glükóz-koncentrációval rendelkezı oldathoz (pH=5,1, 0,05 M acetát puffer) 1 mg cm^-3 glükóz-oxidáz-koncentrációval rendelkezı törzsoldatból 0,1 cm³

mennyiséget mértem, majd 10 percig tartó 150 rpm mellett történı rázatás után az oldatot kiforraltam és mértem annak glükóz-koncentrációját.

A rögzített enzimaktivitások értékét 450 mg immobilizált biokatalizátor jelenlétében 5 cm³, 10 mg cm^-3 kiindulási glükóz-koncentrációval rendelkezı oldatban (pH=5,1, 0,05 M acetát puffer) 4 óra alatt mérhetı szubsztrátfogyásból számítottam ki. A méréseket fotometriás módszer segítségével követtem nyomon o-toluidin reagens alkalmazása mellett [COOPER ésMCDANIEL, 1970]. A módszer során 4,5 cm³ o-toluidin reagenst adtam 0,5 cm³ mintához, majd az elegyet 8 percig forraltam. Hőtés után az oldat abszorbanciája 620 nm-en detektálható. A módszer 0,1 és 0,4 mg cm^-3 glükóz-koncentráció-tartományban megbízható.

y = 1,694x + 0,0455 R² = 0,9971

0 0,2 0,4 0,6 0,8

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

glükózkonc. (mgcm^-3)

ABS

10. ábra: Kalibrálógörbe a glükóz-koncentráció o-toluidin-módszerrel történı spektrofotometriás meghatározásához

3.2.1.3. Kataláz aktivitásának mérési módszere

Az alkalmazott kataláz (SIGMA) aktivitását a következıképp jellemeztem: Egy U kataláz aktivitás azt az enzimennyiséget jelöli, amely egy perc alatt pH=4,5 és 25°C-on egy µmol hidrogén-peroxid bontását végzi [PFIFFERI és mtsai, 1993].

Az oldott állapotú enzim aktivitásának meghatározása során 10 cm³, 1 mg cm^-3 kiindulási H2O2-koncentrációval rendelkezı oldathoz (pH=4,5, 0,1 M citrát-foszfát puffer)

0,5 mg cm^-3 kataláz-koncentrációval rendelkezı törzsoldatból 0,1 cm³ mennyiséget mértem, majd 10 percig tartó 150 rpm mellett történı rázatás után meghatároztam annak H2O2-koncentrációját.

A rögzített enzimkészítmény kataláz-aktivitásának értékét a 0,08 mg dm^-3 kiindulási H2O2 koncentrációval rendelkezı oldatokban (pH=4,5, 0,1 M citrát-foszfát puffer) adott idı alatt mérhetı szubsztrátfogyásból számítottam ki. A mérés során 450 mg immobilizált enzimkészítményt adtam 10 cm³ H₂O₂ oldathoz, majd a reakcióelegyet 30 percen keresztül 150 rpm mellett rázattam.

y = 0,2698x + 0,0301 R² = 0,9956

0 0,2 0,4 0,6 0,8

0 0,5 1 1,5 2 2,5

H2O2 (µmolcm^-3)

ABS

11. ábra: Kalibrálógörbe a H2O2-koncentráció spektrofotometriás meghatározásához A minták elemzését fotometriás módszer segítségével végeztem. A H₂O₂ mennyiségi meghatározása Ti(IV)-szulfát reagens felhasználásával [PFIFFERI és mtsai, 1993] történt. 1 cm³ mintához 1 cm³ Ti(IV)-szulfát reagenst adtam, majd 415 nm-en fotometráltam. A módszer 20 és 120 µg cm^-3 H2O2 koncentráció-tartományban megbízhatóan alkalmazható.