Prebiotikus hatású fruktooligoszacharidok enzimkatalitikus szintézise integrált rendszerben

PANNON EGYETEM

VEGYÉSZMÉRNÖKI TUDOMÁNYOK ÉS ANYAGTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA

DOKTORI (PH.D.)ÉRTEKEZÉS

PREBIOTIKUS HATÁSÚ FRUKTOOLIGOSZACHARIDOK ENZIMKATALITIKUS SZINTÉZISE INTEGRÁLT RENDSZERBEN

Készítette:

C

Z

okl. környezetmérnök

Témavezetı:

D

. S

C

egyetemi docens

P

E

M

K

K

I

2008

PREBIOTIKUS HATÁSÚ FRUKTOOLIGOSZACHARIDOK ENZIMKATALITIKUS SZINTÉZISE INTEGRÁLT RENDSZERBEN

Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében Írta:

... Csanádi Zsófia ...

Készült a Pannon Egyetem ...Vegyészmérnöki- és Anyagtudományok Doktori...

iskolája/programja/alprogramja keretében

Témavezetı: …Dr. Sisak Csaba...

Elfogadásra javaslom (igen / nem)

(aláírás) A jelölt a doktori szigorlaton …... % -ot ért el,

Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom:

Bíráló neve: …... …... igen /nem

……….

(aláírás) Bíráló neve: …... …...) igen /nem

……….

(aláírás) Bíráló neve: …... …...) igen /nem

……….

(aláírás) A jelölt az értekezés nyilvános vitáján …...% - ot ért el.

Veszprém/Keszthely,

……….

a Bíráló Bizottság elnöke A doktori (PhD) oklevél minısítése…...

………

Az EDT elnöke

TARTALOMJEGYZÉK

KIVONAT...7

ABSTRACT...8

AUSZUG...9

1. BEVEZETÉS...10

2. IRODALMI ÖSSZEFOGLALÁS...13

2.1. Funkcionális élelmiszerek...13

2.2. Pre- és probiotikumok...17

2.2.1. Prebiotikus hatású egyszerő és összetett szénhidrátok...17

2.2.1.1. A fruktooligoszacharid típusú prebiotikumok hatása és felhasználásuk....19

2.2.2. Probiotikumok...22

2.3. A fruktooligoszacharidok elıállításának enzimatikus lehetıségei...25

2.3.1. A transzferázok szerepe a fruktooligoszacharidok szintézisében...27

2.3.2. A hidrolázok szerepe a fruktooligoszacharidok elıállításában...30

2.4. A szimultán termékkinyerés jelentısége összetett biokatalitikus folyamatokban...32

2.4.1. A fruktooligoszacharid szintézis melléktermékének eliminálási lehetıségei.34 2.5. A szilárd fázisú biokatalízis...34

2.5.1. A rögzített enzimek jelentısége...35

2.5.2. Az enzimrögzítés fontosabb típusai...36

2.5.3. Rögzített enzimek alkalmazása a fruktooligoszacharidok elıállítására...39

2.6. Szilárd fázisú biokatalizátorokkal mőködı reaktorok...41

2.6.1. Szakaszos mőködéső mechanikusan kevert tankreaktor...43

2.6.2. Folyamatos átáramlású kevert tankreaktor...44

2.6.3. Állóágyas oszlopreaktor...45

2.6.4. Fluidizációs reaktor...46

2.7. Integrált bioreaktor-rendszerek...47

3. KÍSÉRLETI ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK...49

3.1. Felhasznált anyagok...49

3.1.1. Enzimkészítmények...49

3.1.1.1. Fruktooligoszacharidok szintéziséhez használt enzimkészítmények...49

3.1.1.2. Glükóz, mint melléktermék eliminálására használt enzimkészítmények...49

3.1.2. Hordozó...50

3.1.3. Kötıreagens...50

3.1.4. Egyéb vegyszerek...50

3.2. Mérési módszerek...51

3.2.1. Az enzimaktivitások meghatározása...51

3.2.1.1. Fruktozil-transzferáz aktivitásának mérési módszere...51

3.2.1.2. Glükóz-oxidáz aktivitásának mérési módszere...53

3.2.1.3. Kataláz aktivitásának mérési módszere...54

3.2.2. Analitikai módszerek, alkalmazott berendezések és mérımőszerek...55

4. EREDMÉNYEK...58

4.1. Az enzimkészítmények rögzítési módszere...58

4.2. Pectinex Ultra SP-L rögzítésének vizsgálata...60

4.2.1. Optimális rögzítési körülmények megállapítása...60

4.2.1.1. A legkedvezıbb biokatalizátor/hordozó arány megállapítása...61

4.2.1.2. Pectinex Ultra SP-L glutáraldehides rögzítésének idıfüggése...62

4.2.1.3. Pectinex Ultra SP-L glutáraldehides rögzítésének koncentrációfüggése....63

4.2.2. Optimális mőködési körülmények megállapítása...65

4.2.2.1. Oldott állapotú Pectinex Ultra SP-L optimális mőködési körülményeinek megállapítása...65

4.2.2.2. Rögzített Pectinex Ultra SP-L aktivitásának hımérsékletfüggése...65

4.2.2.3. Rögzített Pectinex Ultra SP-L aktivitásának pH függése...66

4.2.2.4. Rögzített Pectinex Ultra SP-L stabilitásának vizsgálata...67

4.2.2.5. Rögzített Pectinex Ultra SP-L aktivitásának szubsztrátfüggése...68

4.3. Fruktooligoszacharidok elıállítása Pectinex Ultra SP-L enzimkészítmény alkalmazásával...70

4.3.1. Oldott állapotú Pectinex Ultra SP-L alkalmazása fruktooligoszacharidok elıállítására rázatott lombikos kísérletek során...70 4.3.2. Rögzített Pectinex Ultra SP-L alkalmazása fruktooligoszacharidok

4.4. A szintézis melléktermékének eltávolítása...74

4.4.1. A glükóz-oxidáz és kataláz koimmobilizálásának vizsgálata...74

4.4.1.1. A glükóz-oxidáz és kataláz enzimek optimális rögzítési körülményeinek megállapítása...75

4.4.1.2. A glükóz-oxidáz – kataláz biokatalizátor optimális mőködési körülményeinek vizsgálata...77

4.4.2. Reaktorkísérletek...80

4.4.2.1. Oxigénbeviteli vizsgálatok a folyadékfázisban...80

4.4.2.2. Glükóz-eltávolítás vizsgálata...85

4.5. Integrált fruktooligoszacharid-szintézis és glükóz-eltávolítás megvalósítása.88 4.5.1. Integrált rendszerő reaktorkísérletek...88

5. ÖSSZEFOGLALÁS...93

6. IRODALOMJEGYZÉK...95

TÉZISEK...104

THESES...106

PUBLIKÁCIÓK...107

FÜGGELÉK...112

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS...115

KIVONAT

A disszertációban a számos elınyös élettani tulajdonsággal rendelkezı, prebiotikus hatású rövid láncú fruktooligoszacharidok enzimatikus úton történı elıállításának vizsgálata kerül bemutatásra. A vizsgált reakcióban szacharóz kiindulási anyagból fruktozil-transzferáz enzim segítségével rövid láncú fruktooligoszacharidok elegye és melléktermékként glükóz képzıdik, mely utóbbi komponens a reakció inhibitora.

A szerzı munkája során egy, a fruktooligoszacharidok szintézisére alkalmazható enzimkészítmény rögzítésére megfelelı hordozó kiválasztása és egy újszerő kombinált kétlépéses rögzítési módszer kialakítása után meghatározta a biokatalizátor rögzítési körülményeit. Az így kialakított immobilizált enzimkészítmény mőködési körülményeinek meghatározásával egy, a fruktooligoszacharidok elıállítására alkalmas szilárd fázisú biokatalizátort alakított ki, melynek alkalmazásával vizsgálta a fruktooligoszacharidok elıállítási lehetıségeit.

A szintézisreakcióban melléktermékként keletkezı glükóz eltávolítására a szerzı egy szilárd fázisú koimmobilizált glükóz-oxidáz – kataláz biokatalizátort hozott létre. Munkája során meghatározta annak rögzítési és mőködési körülményeit, valamint vizsgálta mőködését.

Az együttes termékelıállítás és melléktermék eltávolítás együttes megvalósítására egy integrált reaktor-rendszert alakított ki, majd tanulmányozta annak mőködését.

ABSTRACT

Enzymatic synthesis of prebiotic fructooligosaccharides in integrated system

In this work enzymatic production of the prebiotic fructooligosaccharides was investigated. In the synthesis reaction a mixture of fructooligosaccharides with low molecular weight and glucose as a by-product were formed from sucrose as a raw material, the process is catalysed by fructosyl-transferase enzyme.

A solid-phase biocatalyst for the production of fructooligosaccharides was formed from a commercial grade complex enzyme product. An immobilization method was worked out with the combination of adsorption and cross-linking by glutaraldehyde treatment. For the elimination of glucose by-product a co-immobilized glucose oxidase – catalase biocatalyst was prepared from soluble glucose oxidase and catalase both of them of fine chemical grade. The immobilization parameters and operational conditions have been optimized for the biocatalysts.

An integrated reactor system for the simultaneous fructooligosaccharide production and glucose elimination was constructed and studied.

AUSZUG

Enzymatische Synthese von prebiotischen Fructooligosacchariden in integriertem System

In dieser Arbeit wurde die enzymatische Produktion von prebiotischer Fructooligosacchariden untersucht. Während der Reaktion wurde eine Mischung von Fructooligosacchariden und als Nebenprodukt Glukose aus dem Ausgangsstoff Saccharose mit Hilfe von Fructosyltransferase Enzym gebildet.

Ein festphasiger biochemischer Katalysator für die Produktion von Fructooligosacchariden wurde aus einem komplizierten Enzymprodukt hergestellt. Eine neue, zweistufige Immobilisierungmethode wurde für die Vernetzung durch Glutaraldehyd- behandlung ausgearbeitet. Für die Beseitigung der Glukoseinhibition wurde aus einem feinen Biokatalysator Glukose Oxydase-Katalase eine Co-Immobilisierung durchgeführt und das Produkt untersucht. Die Immobilisierungsparameter und die Betriebsbedingungen sind für die biochemischen Katalysatoren optimiert worden.

Ein integriertes Reaktorsystem für die simultane Fructooligosaccharidproduktion und Glukosebeseitigung wurde konstruiert und studiert.

1. BEVEZETÉS

Az utóbbi idıben megnövekedett érdeklıdés tapasztalható az egészséges táplálkozás és étrend, valamint a természetes anyagokból származó táplálék-kiegészítık iránt. A fruktooligoszacharidok számos olyan elınyös tulajdonsággal rendelkeznek, amelyek lehetıvé teszik széleskörő élelmiszeripari és takarmányozási célú alkalmazásukat. Az emésztıszervrendszer enzimei nem képesek lebontani, így a szervezet energiaforrásként nem képes felhasználni ıket, kalóriatartalmuk kb. 8 kJ g^-1 (2 Kcal g^-1) [FARR, 1997]. Ebbıl adódóan diabetikus és alacsony kalóriatartalmú termékek gyártására is felhasználhatók, bár édesítıhatásuk csupán a szacharóz kb. egyharmadának felel meg. Nem hidrolizálódnak a szájüregben sem, ezért nincs fogszuvasodást elıidézı hatásuk [BLOCH és mtsai, 1995].

Ezeken kívül rendelkeznek egy lényeges tulajdonsággal, amely alapvetı fontosságú az ún.

funkcionális élelmiszerekben való alkalmazásuk szempontjából. Kedvezı hatással vannak a bélflóra baktériumainak (Bifidobacteria, Lactobacillus sp.) szaporodására és mőködésére, amelyek a szervezet egészségének fenntartásában fontos szerepet játszanak: több vitamin termelıdésében (K, B) is részt vesznek, valamint olyan rövidláncú zsírsavakat hoznak létre (pl.: tejsav, ecetsav, propionsav, vajsav), amelyek a bélsejtek számára szolgálnak táplálékul [HILLIAM, 1998]. Ezen kívül segítenek megakadályozni az emésztırendszerbe bekerült patogén kórokozók elszaporodását is [GOLDBERG, 1994].

A fruktooligoszacharidok szerkezetüket tekintve egy glükóz egységbıl és az ahhoz kapcsolódó két, illetve több fruktóz egységbıl felépülı nyílt láncú molekulák. A homológ sor elsı három és leggyakrabban elıforduló képviselıje a kesztóz (GF2), a nisztóz (GF3) és a fruktozil-nisztóz (GF4).

A természetben számos növényben (pl.: hagyma, cikória, cukorrépa, gabona, rizs) megtalálhatók, azonban viszonylag kis koncentrációban. Mesterséges úton történı elıállításuk egyik lehetséges fajtája az enzimkatalitikus szintézis. Ennek során szacharóz (GF) kiindulási anyagból az ún. fruktozil-transzferáz (Ft-áz) enzim segítségével alakítható ki a rövid láncú fruktooligoszacharidok elegye több lépésben. Az elegy a GF2, GF3, GF4 és az át nem alakult szacharóz mellett melléktermékként keletkezı glükózt is tartalmaz. Mivel a glükóz a szintézisreakció kompetitív inhibítora, így annak eltávolítása nélkül maximálisan kb. 60 %-os fruktooligoszacharid-hozam érhetı el. Ezért a glükóz folyamatos eltávolítása a

rendszerbıl jelentısen megnövelheti az elıállított termékkoncentrációt. A glükóz elimináció egyik lehetséges és viszonylag olcsó fajtája egy másik enzimes rendszer alkalmazása, melynek során immobilizált glükóz-oxidázt (GOD) használhatunk a glükóz eltávolítására.

Az enzimkatalitikus szintézis megvalósításának két alapvetı módja lehetséges. Az egyik során szakaszos üzemmódban szabad állapotú enzimmel, illetve az enzimet tartalmazó sejttel történik a szintézis. A másik esetben valamilyen szilárd fázisú hordozóhoz rögzítetten alkalmazzuk a biokatalizátort, melynek révén félfolyamatos, illetve folyamatos üzemmód is megvalósíthatóvá válik. A rögzítésre leggyakrabban Ca-alginát gélbezárást, illetve adszorpciós technikát alkalmaznak.

Célkitőzések

Doktori munkámat a Pannon Egyetem Mőszaki Kémiai Kutató Intézetében folyó, a rögzített biokatalizátorok elıállításához, alkalmazásához, illetve az azokkal megvalósított biotechnológiai mőveletek tanulmányozásához kapcsolódó korábbi kutatási tevékenység keretein belül valósítottam meg. A kidolgozandó PhD téma egy, az Oktatási Minisztérium támogatásával folyó, a "Biotechnológia 2002" programba tartozó kutatási projekt (Molekuláris biotechnológiai és integrált fruktooligoszacharid termelı eljárás kidolgozása és sertés takarmányozási célú alkalmazása) részeként került kiírásra a Pannon (Veszprémi) Egyetem Vegyészmérnöki Doktori Iskolájában 2002-ben. A projekt célja az volt, hogy egy kereskedelembıl beszerezhetı és/vagy az egyik partner által géntechnikai módosítással elıállított fruktozil-transzferáz enzimekkel prebiotikus hatású fruktooligoszacharidokat szintetizáljunk és azokat megfelelı formázás után a másik partner alkalmazza fiatal sertések etetési kísérleteiben.

Munkám kezdetekor célkitőzéseink a következık voltak:

1. Kereskedelembıl beszerzett, (illetve a kooperációs partnerektıl kapott) fruktozil- transzferáz enzim rögzítésére alkalmas módszer(ek) és hordozó(k) kiválasztása.

2. A rögzítés optimális körülményeinek (hımérséklet, pH, optimális szubsztrátkoncentráció) meghatározása és a rögzítés eredményességének vizsgálata lombikos kísérletekkel.

3. A szilárd fázisú készítmény katalitikus viselkedésének jellemzése, fruktooligoszacharidok elıállításának vizsgálata során.

4. Kísérletek a melléktermékként keletkezı glükóznak a fruktooligoszacharid-szintézissel szimultán, biokatalitikus úton történı eltávolítására.

5. A glükóz eliminációhoz alkalmazható biokatalizátor elıállítása és vizsgálata.

6. Az együttes termékelıállítás és szimultán melléktermék szeparáció megvalósítására alkalmas laboratóriumi mérető reaktor összeállítása és mőködésének vizsgálata.

A téma kidolgozásához rendelkezésemre állt az enzimaktivitás mérésekhez szükséges laborháttér, kereskedelmi forgalomból megszereztük az irodalmi adatok alapján a fruktooligoszacharid szintézisre alkalmazható ipari enzimet, biztosítva volt a kellı eszközrendszer az enzim immobilizálásához és a szükséges analitikai vizsgálatokhoz.

Munkám során párhuzamosan két, fruktooligoszacharidok elıállítására alkalmas biokatalizátor vizsgálatával foglalkoztam. Az egyik egy kereskedelembıl beszerezhetı enzimkészítmény, a másik pedig egy kooperációs partner által, genetikailag módosított mikroba alkalmazásával elıállított és kinyert sejtlizátum volt. Ez utóbbi minısége azonban nem volt kellıen homogén, az egyes sarzsok aktivitása között lényeges eltérés mutatkozott.

Így gyakorlati célú alkalmazásra megfelelınek bizonyult ugyan és kísérleteink során ezzel a biokatalizátorral valósítottuk meg a fruktooligoszacharidok nagylabor léptékő elıállítását, a doktori munkámmal kapcsolatos minıségi elıírások, illetve az abban foglalt vizsgálatok megkövetelt színvonala miatt azonban egy kereskedelmi forgalomból származó enzimkészítmény vizsgálata és az annak során kapott eredmények felhasználása volt szükséges. Emiatt dolgozatomban kizárólag ezzel az enzimmel elvégzett kísérletek és azok eredményei szerepelnek.

2. IRODALMI ÖSSZEFOGLALÁS

2.1. Funkcionális élelmiszerek

Az egyre intenzívebb fogyasztói igényeknek megfelelıen az élelmiszertudomány az utóbbi évtizedekben fokozott figyelmet fordít az egészséges és kedvezı élettani hatású élelmiszerek vizsgálatára, illetve kutatására. A folyamat eredményeképp „táplálkozástani”

szótárunk az ún. funkcionális élelmiszerek fogalmával bıvült.

Szervezetünk egészségi állapotát nagymértékben befolyásolja az elfogyasztott táplálék mennyisége és minısége. Élettani kutatások során kimutatták, hogy a rákos megbetegedések közel egyharmadáért a helytelen táplálkozás és étrend tehetı felelıssé [EDDY, 1986], ezen kívül egyértelmő a kapcsolat a magas vérnyomás és annak szövıdményeivel, valamint a szív- és érrendszeri megbetegedésekkel is. A helyes táplálkozás ezzel szemben kifejezetten betegségmegelızı, illetve gyógyulást elısegítı hatású lehet, lassíthatja az öregedési folyamatokat, valamint növelheti mind a fizikai, mind a szellemi teljesítıképességet [SANDERS, 1998]. Az 1. táblázatban bizonyos tápanyagok és azok fiziológiai hatására szerepel néhány példa.

1. táblázat: Néhány megbetegedés és azok megelızésére és kezelésére alkalmazható táplálék-összetevı

Betegség Funkcionális élelmiszer összetevı Ízületi gyulladás Ω-3-zsírsavak, gyömbérkivonat, kollagén

Magas vérnyomás γ-amino-vajsav, pektin

Csontritkulás Kalcium, kazein foszfopeptidek Szív- és érrendszeri

megbetegedések

β-karotin, fokhagyma, növényi szterinek és polifenolok, antioxidánsok

Magas koleszterin-szint Probiotikumok, pektin, szójarost Rákos megbetegedések Zöld tea, fokhagyma, növényi szterinek és

polifenolok, pre- és probiotikumok, antioxidánsok

Az egészségmegırzı és egészségjavító táplálkozásnak megfelelıen kialakított összetétellel rendelkezı speciális biológiailag és fiziológiailag aktív komponenseket tartalmazó ún. funkcionális élelmiszerek népszerősége és elterjedése az utóbbi években egyre növekszik. Definíció szerint funkcionális élelmiszernek tekinthetı minden olyan táplálék, illetve táplálék-összetevı, amely a hagyományos tápértéke mellett valamilyen kedvezı élettani hatással rendelkezik [EDDY, 1986].

Ezen termékek fejlesztése és forgalmazása az 1980-as évek elsı felében eredetileg Japánból [FARR, 1997] indult és ott azóta is népszerőek, de ma már az Egyesült Államok [BLOCH és mtsai, 1995], illetve Európa, elsısorban Franciaország és az Egyesült Királyság [HILLIAM, 1998] élelmiszerpiacán is újabb és újabb termékek jelennek meg [GOLDBERG, 1994]. Ezen kívül a funkcionális élelmiszerek iránti megnövekedett érdeklıdés nem csak az élelmiszeriparban, de a gyógyszeriparban is megmutatkozik. A funkcionális élelmiszerek ötlete, illetve vizsgálata alapvetıen a lakosság általános egészségi állapotának javítása érdekében alakult ki. 1984-ben Japánban [FARR, 1997] állami támogatással egy átfogó nemzeti programot hoztak létre, melynek végeredményeképp kidolgozták a funkcionális élelmiszerekre vonatkozó pontos szabályokat és elıírásokat [FARR, 1997; EDDY, 1986].

Ezek képezik azóta is az alapját a világ többi részén is egyre inkább terjeszkedı funkcionális élelmiszerek piaci szabályozásának, amely azonban még messze nem tekinthetı egységesnek és véglegesnek. Ennek oka abban keresendı, hogy míg a funkcionális élelmiszerek választéka egyre bıvül, azok kedvezı táplálkozási, biológiai, valamint élettani hatásának tudományos megalapozottsága az esetek többségében még nem teljes [BLOCH és mtsai, 1995]. Számos élettani kutatás, epidemiológiai, állat- és humán kísérlet szükséges még a továbbiakban ahhoz, hogy azok ténylegesen helyet kapjanak az élelmiszer-, valamint gyógyszeripar piacán és megfeleljenek a szigorú élelmiszer- és gyógyszeripari elıírásoknak, valamint nem mellékesen, a növekvı fogyasztói igényeknek.

Egy, az Egyesült Államok-béli felmérés szerint [GILBERT, 2000] a funkcionális élelmiszerek iránti megnövekedett érdeklıdés és azok egyre nagyobb piaci térnyerése több okra vezethetı vissza [KATAN, 1999]:

A fogyasztók a már kialakult betegség gyógyításánál fontosabbnak tartják a betegségek megelızését;

Az egészségügyi kezelés költségeinek megemelkedése, illetve azok csökkentésére irányuló erıfeszítések, mivel a betegségek megelızése kisebb költségekkel jár, mint a már kialakultak kezelése;

Az egyre szélesebb körő fogyasztói ismeretek, tájékozottság és tudatosság is az okok között szerepel. A média egyre nagyobb figyelmet fordít a táplálkozás és az egészségmegırzés közötti kapcsolatokra, így a fogyasztók érdeklıdése fokozottan erre a témára irányul. Ezen kívül elsısorban az Egyesült Államokban, de több nyugat-európai országban is a kormányok és az egészségügyi szervezetek is egyre nagyobb figyelmet fordítanak az egészséges életmód propagálására;

A fejlett országok lakosságának elöregedése;

A növekvı környezeti szennyezésekbıl eredı veszélyek ellensúlyozása, hiszen számos krónikus megbetegedésben kimutatottan jelentıs szerepet játszanak a káros környezeti tényezık;

Az utóbbi idıben elsısorban a humánbiológia területén elszaporodott új tudományos eredmények és jelentıs újdonságok, valamint a funkcionális élelmiszerekre irányuló fogyasztói érdeklıdés ösztönzıleg hat egymásra.

A funkcionális élelmiszereknek alapvetıen két csoportja különböztethetı meg [ROBERFROID, 1999]: az egyik a szerkezeti kölcsönhatáson keresztül ható típus, a másik pedig a betegségek kialakulásának kockázatát csökkentı típus. Az elsı csoportba tartozó élelmiszerek és a szervezet adott élettani funkciója között valamilyen kölcsönhatás alakul ki, kedvezıen befolyásolva annak mőködését (pl. antioxidáns vegyületek - oxidatív stressz). A második csoport képviselıi esetében az adott vegyületek nem közvetlenül az adott betegséget szőntetik meg, hanem közvetett úton annak kockázatát csökkentik (pl.

rákos megbetegedések).

A funkcionális élelmiszerek között fıként a pre- és probiotikumok, élelmi rostok, halolaj, vitaminok, ásványi anyagok, antioxidánsok terjedtek el. Nagy figyelem irányul az utóbbi idıben a probiotikus tejtermékekre, azon belül is a joghurtokra, illetve a vitaminokkal, kalciummal és ásványi anyagokkal dúsított tejtermékekre. Ezek között mára már szélesebb körben elterjedtek és a funkcionális élelmiszerek piacán stabil szerepet

alkalmazásával készült tejtermékek. Ezen kívül elterjedtek még: gyümölcslevek, üdítıitalok, a sütıipar és gabonapelyhek piacán a vitaminokkal, ásványi anyagokkal és kalciummal dúsított termékek, csökkentett koleszterin-tartalmú és növényi szterinekkel, valamint vitaminokkal dúsított margarinkészítmények. Ma még fıként csak Japánban népszerőek az élelmi rostokkal dúsított üdítıitalok és élelmiszerek; elsısorban szintén Japánban és az utóbbi idıben Franciaországban alkalmazzák a prebiotikus hatású oligoszacharidokat az édességek és sütıipar területén [HILLIAM, 1998; GILBERT, 2000].

Magyarországon is széleskörő kutatási eredmények bizonyítják a funkcionális élelmiszerek iránti megnövekedett figyelmet. A budapesti Corvinus Egyetem kutatói, Rezessyné Dr. Szabó Judit, Dr. Hoschke Ágoston és Dr. Mayer Ágnes kutatásai között szerepel probiotikus, humán forrásból izolált Bifidobacterium törzsek szeparációja, azonosítása, fiziológiai, biokémiai és funkcionális jellemzésük [MAYER és mtsai, 2003a, 2003b; SZEKER és mtsai, 2005].

2. táblázat: A Magyar Tejgazdasági Kísérleti Intézetben kifejlesztett probiotikus tejtermékek és táplálék-kiegészítık

Márkanév Termék

(Tejtermékek)

SynBiofir^® Ivókefir

Probioghurt^® Ivójoghurt

HunCult^® Fermentált ital

Prémium^® Habart tejföl

Új Party^® Light vajkrém

Aktivit^® Túró Rudi

Probios^® Sajtkrém

LactoDrink^® Savó- és íróital

(Étrend-kiegészítık)

Bonolact^® Probiotikum

(Flórafenntartó felnıtteknek) Regeneral

(Flóraregeneráló felnıtteknek) Junior

(Csecsemıknek, gyermekeknek)

A gyakorlatban is megvalósult példaként említhetı a pécsi Magyar Tejgazdasági Kísérleti Intézetben, Szakály Sándor professzor irányításával zajlott kutatási-fejlesztési program, amelynek során több probiotikus tejterméket és táplálék-kiegészítıt dolgoztak ki, mindezeket táblázatos formában is összefoglaltam (2. táblázat).

Közülük azóta néhánnyal kereskedelmi forgalomban is találkozhatunk, ezeket a 2.

táblázatban kiemelve tőntettem fel. A SynBiofir^® ivókefir például 2005-ben világújdonságnak számított és a Kiváló Magyar Élelmiszer védjegyet is elnyerte.

[SCHAFFER és mtsai, 2005].

2.2. Pre- és probiotikumok

A funkcionális élelmiszerek fajtái közé tartoznak az ún. pre- és probiotikumok, amelyek között alapvetı mőködési és szerkezeti különbség van.

Prebiotikumnak tekinthetı minden olyan, a bélrendszer felsı traktusaiban (szájüreg- gyomor-vékonybél) nem emészthetı táplálék-alkotórész, amely serkenti a vastagbél hasznos mikrobáinak növekedését, illetve aktivitását.

Ezzel szemben a probiotikum kifejezés olyan élı mikrobiális táplálék-kiegészítıt takar, amely a vastagbél bélflórájának mikrobiális egyensúlyának javításával a gazdaszervezetet elınyösen érinti. Ebbe a csoportba tartozó mikrobák pl. Bifidobacterium adolescentis, B. bifidum, B. longum, B. infantis, Lactobacillus acidophilus, L. casei, L.

delbruekii, L. plantarum.

2.2.1. Prebiotikus hatású egyszerő és összetett szénhidrátok

A leggyakoribb prebiotikus hatású vegyületek általában az oligoszacharidok [GRITTENDEN és PLAYNE, 1996] közé tartoznak, ilyenek például a fruktooligoszacharidok, galaktooligoszacharidok, inulin, leván, laktulóz, izomaltooligoszacharidok, xilooligoszacharidok.

Oligoszacharid megnevezéssel a 3-10 monomer egységbıl felépülı láncokat jelölik, amelyek felépülhetnek azonos, de eltérı monomerekbıl is. Ezek variációja és száma

található meg természetes eredető tápanyagokban. Mesterséges elıállításuk lehetıségei összefoglalóan az 1. és 2. ábrán láthatóak [GRITTENDEN ésPLAYNE, 1996].

1. ábra: Galaktooligoszacharidok elıállítása laktózból (Glu=glükóz, Gal=galaktóz, Fru=fruktóz)

Az oligoszacharidok vízben oldható vegyültek, melyek édesítıhatása kb. 30-60 %-a a szacharózénak [GRITTENDEN ésPLAYNE, 1996] és a molekula szerkezetétıl és nagyságától függı. Ez a viszonylag alacsony édesítıhatás olyan szempontból is elınyössé válhat, hogy egyéb ízek intenzitását nem nyomja el. Egyéb mono-, illetve diszacharidokhoz viszonyítva a nagyobb molekulatömeg miatt az oligoszacharidok oldatát nagyobb viszkozitás jellemzi, melyet élelmiszeripari alkalmazásoknál figyelembe kell venni, hiszen nemcsak az adott készítmény állagát, de fagyáspontját is megváltoztathatják, mely tulajdonság szintén elınyösen is kihasználható. Ezen kívül egyes készítményeknél a hıkezelés során fellépı barnulás folyamata is szabályozható általuk, valamint a nagyobb nedvesség-visszatartó képesség miatt a kiszáradás is elkerülhetı. Ezen kedvezı fizikai-kémiai tulajdonságok ellenére alkalmazásuk fı területe mégis csak a prebiotikus hatásuk (2.2 fejezet) miatt az ún.

+ szacharóz

β-fruktofuranozidáz alkáli-izomerizáció

Galakto-oligoszacharidok α-D-Glu-(1,4)-{β-D-Gal-1,6}_n, n=2-5

β-galaktozidáz Laktóz

β-D-Gal-(1,4)-α-D-Glu

Laktulóz β-D-Gal-(1,4)-β-D-Fru

Lakto-szacharóz

β-D-Gal-(1,4)-α-D-Glu-(1,2)-β-D-Fru (1,2)-

funkcionális élelmiszerekben (2.1 fejezet) jellemzı. Kísérletek során kimutatták, hogy napi 4-10 g fruktooligoszacharid bevitele mellett jelentkeznek annak kedvezı élettani hatásai.

2. ábra: Oligoszacharidok elıállítása szacharózból és inulinból (Glu=glükóz, Gal=galaktóz, Fru=fruktóz)

2.2.1.1. A fruktooligoszacharid típusú prebiotikumok hatása és felhasználásuk

A természetes eredető oligoszacharidok nagy jelentıségő képviselıi a fruktooligoszacharidok. Ezek számos olyan elınyös tulajdonsággal rendelkeznek, amelyek lehetıvé teszik széles körő élelmiszeripari és takarmányozási célú alkalmazásukat [ASP, 1996; BORNET és mtsai, 2002]:

inulináz

palatináz glukántranszferáz

+ laktóz

β-fruktofuranozidáz β-fruktofuranozidáz

Glikozil-szacharóz

α-D-Glu-(1,4)-α-D-Glu-(1,2)-β-D-Fru + maltóz

Szacharóz α-D-Glu-(1,2)-β-D-Fru

Fruktooligoszacharidok

α-D-Glu-(1,2)-{β-D-Fru-(1,2)}n, n=2-9 β-D-Fru-(1,2)-{β-D-Fru-(1,2)}n, n=1-9

Lakto-szacharóz

β-D-Gal-(1,4)-α-D-Glu-(1,2)-β-D-Fru (1,2)-

Palatinóz-oligoszacharidok {α-D-Glu-(1,6)-D-Fru}n, n=2-4

Inulin

α-D-Glu-(1,2)-{β-D-Fru-(1,2)}n, n>10

Édesítıhatásuk a szacharóz harmadáénak felel meg, emiatt jól alkalmazhatók olyan élelmiszerek esetében, amelyek elıállításához a szacharóz, illetve egyéb édesítıanyagok túl édesnek bizonyulnak;

A cukrok fogszuvasodást elıidézı hatása a szájüregben elıforduló Streptococcus mutans mőködésének következménye, amely képes a mono- és diszacharidokat savvá hidrolizálni, melyek a fogzománc felületén kialakuló lyukakért felelısek. A fruktooligoszacharidoknak ezzel szemben, mivel nem hidrolizálódnak a szájüregben, nincs fogszuvasodást elıidézı hatásuk sem [MOYNIHAN, 1998], azaz nem kariogének;

A vastagbél nyálkahártya pH-jának csökkentése révén növelik bizonyos ásványi anyagok, így a kalcium, magnézium, cink, vas és foszfor oldódását és így elısegítik azok felszívódását [CORSINI és mtsai, 1995a; CORSINI ésmtsai,1995b]. A kalcium és magnézium felszívódásának javításával lényegesen csökkenthetı a csontritkulás kialakulásának veszélye, míg a vas jobb felhasználásával a vérszegénység kialakulása elızhetı meg [MOLIS és mtsai,1996];

Ezeken kívül rendelkeznek a korábbiakban már ismertetett (2.2 fejezet) prebiotikus tulajdonsággal is. Kedvezı hatással vannak a bélflóra baktériumainak (Bifidobacteria, Lactobacillus sp.) szaporodására. Mivel azok szén-dioxiddá és olyan rövidláncú zsírsavakká fermentálják ıket (tejsav, ecetsav, propionsav, vajsav), amelyek a szervezet egészségének fenntartásában fontos szerepet játszanak.

Ezen ún. probiotikus hatást és annak kedvezı élettani következményeit szintén egy korábbi fejezetben ismertettem (2.2 fejezet).

Számos klinikai kísérlet által alátámasztott tanulmány is bizonyítja [TUNGLAND és MEYER, 2002; SCHOLZ-AHRENS, 2001], hogy a fruktooligoszacharidokat az emésztıszervrendszer felsı traktusainak (szájüreg, gyomor, vékonybél) enzimei (pl.

α-amiláz, szacharáz, maltáz) nem képesek lebontani, így a szervezet közvetlen energiaforrásként nem képes felhasználni ıket, kalóriatartalmuk mindössze kb. 8 kJ g^-1. Emiatt diabetikus és alacsony kalóriatartalmú termékek gyártására is felhasználhatók [LUO és mtsai, 1996].

A fruktooligoszacharidok csoportjának szakirodalmi megítélése nem teljesen egységes. A szakirodalomban találkozhatunk a fruktánok, glükofruktozánok és inulin- típusú oligoszacharidok elnevezéssel is.

A fruktán típusú vegyületeknek alapvetıen 3 csoportját különböztethetjük meg:

1. Inulin típusú vegyületek, amelyekhez a lineáris β-(2-1)-fruktánok tartoznak, amelyeket egyébként glükofruktozánoknak is neveznek.

2. Ezek megkülönböztetendıek a második típustól, az ún. leván-típusú oligoszacharidoktól, melyek valójában β-(2-6)-fruktánok.

3. A harmadik csoportba pedig a β-(2-1)-, és a β-(2-6)-kötéseket egyaránt tartalmazó fruktánok tartoznak.

A többség azonban azokat a molekulákat tekinti a rövid láncú fruktooligoszacharidok csoport tagjának, melyek szerkezetüket tekintve egy glükóz egységbıl és az ahhoz β-2-1 glikozidos kötéssel kapcsolódó két, három, négy, illetve több fruktóz egységbıl felépülı nyílt láncú molekulák.

.

3. ábra: A fruktooligoszacharidok szerkezete kesztóz

GF₂

nisztóz GF3

fruktozil-nisztóz GF4

A homológ sor elsı három és leggyakrabban elıforduló képviselıje (3. ábra) az 1- kesztóz (β-D-fruktofuranozil-(2→1)2-α-D-glükopiranozid, GF2), a nisztóz (β-D- fruktofuranozil-(2→1)3-α-D-glükopiranozid, GF3) és a fruktozil-nisztóz (β-D- fruktofuranozil-(2→1)4-α-D-glükopiranozid, GF4) [YUN, 1996]. Az egyes molekulák moláris tömegei a következık: 1-kesztóz = 504 g mol^-1, nisztóz = 667 g mol^-1, fruktozil- nisztóz = 829 g mol^-1.

A természetben számos növényben, például banán, hagyma, fokhagyma, cikória, cukorrépa, gabona, rizs megtalálhatók, valamint a méz is tartalmaz fruktooligoszacharidokat, azonban viszonylag kis koncentrációban. A 3. táblázatban néhány példa látható a fruktooligoszacharidok természetes elıfordulására [SANGEETHA és mtsai, 2005].

3. táblázat: Néhány növény természetes fruktooligoszacharid-koncentrációja (m/m%) Növény Fruktooligoszacharid-koncentráció (%)

Árpa 0,15

Paradicsom 0,15

Hagyma 0,23

Banán 0,30

Rozs 0,30

Fokhagyma 0,60

Méz 0,75

2.2.2. Probiotikumok

A 20. század elején Metchnikov orosz Nobel-díjas tudós felfedezte, hogy Dél-Európa egyes részein az emberek sokkal tovább élnek, mint másutt. Kutatásai során megállapította, hogy ezeknek az embereknek az étrendje nagy mennyiségő aludttejet tartalmazott, aminek a készítésében egy bizonyos baktérium (melynek Metchnikov a Lactobacillus bulgaricus nevet adta) is szerepet játszott és a rendszeres fogyasztás miatt ez a baktérium állandóan jelen volt az emésztırendszerükben [WALKER és DUFFY, 1998]. A késıbbiekben

egyértelmően megállapították, hogy a különbözı tejtermékek számos kedvezı hatással bírnak a szervezet egészségének egészére és az emésztırendszerre nézve. Növelik a fertızésekkel szembeni ellenállóképességet, antibakteriális hatást fejtenek ki és erısítik az immunrendszert, segítenek az emésztıszervi megbetegedések gyógyításában, a rákos megbetegedések megelızésében, illetve csökkentik a vér koleszterinszintjét [CREMONINI és mtsai, 2002; MORELLI, 2002].

A vastagbél baktériumai azért képesek táplálékként hasznosítani az oligoszacharidokat és oligofruktánokat, mert β-fruktozidáz (inulináz) enzimükkel képesek hidrolizálni azok β-2-1 kötéseit [BIEDRZYCKA ésBIELECKA, 2004].

A megfelelı probiotikus hatású baktériumokkal szemben támasztott követelmények a következık [WALKER ésDUFFY, 1998]:

Ellenállóképesség az emésztırendszer enzimeivel szemben;

Kolonizáció a vastagbélben;

Bizonyítottan kedvezı hatás az egészségre;

A Bifidobacterium sp. és Lactobacillus sp. probiotikus baktériumok mőködési jellemzıi a következık [LOSADA és OLLEROS, 2002]:

Rövidláncú zsírsavak termelése;

Fermentációs termékeik között több tejsavtermelés, kevesebb ecetsav- és hangyasav-termelés;

Antibakteriális hatású anyagok termelése, kedvezıtlen környezet kialakítása a különféle kórokozók (pl. Clostridium-, Coli-fajok, gombák) számára;

Az immunrendszer mőködésének serkentése;

Segítik a tejfehérjék, az aminosavak, a zsírok és a laktóz feldolgozását;

Részt vesznek a szervezet számára fontos K, illetve B vitaminok szintézisében;

Az orálisan szedett antibiotikumok elpusztítják a hasznos bélflórát, és pl. Candida albicans nevő gomba elszaporodását idézik elı, ami hasmenéshez, székrekedéshez vagy egyéb emésztési zavarokhoz vezet, valamint a szervezet egyéb területeinek is gombásodást idézhet elı: a tüdıben, a szájban, a végtagokon. A probiotikus sejtek a vastagbél nyálkahártyájára tapadva megakadályozzák a patogén mikrobák

megtapadását és elszaporodását, ami a szervezet és az immunrendszer legyengülése esetén könnyen elıfordulhat;

A bél nyálkahártyájának erısítése;

A bélflóra összetételére gyakorolt kedvezı hatás;

A vastagbél nyálkahártyájára tapadva megakadályozzák a patogén mikrobák megtapadását és elszaporodását;

A vér koleszterinszintjének csökkentése a máj lipid-metabolizmusának befolyásolása révén;

A vér LDL szintjének (kis sőrőségő lipoprotein, „rossz koleszterin”) csökkentése: a vastagbél flórája által termelt rövidláncú zsírsavak akadályozzák a koleszterin képzıdését a májban, a koleszterin bioszintézisében közvetlenül résztvevı HMG- CoA (3-hidroxi-3-metil-glutaril) reduktáz enzim mőködésének akadályozásával [CORSINI és mtsai, 1995a; CORSINI ésmtsai, 1995b];

Anti-mutagén és anti-karcinogén hatás;

A vér glükózszintjének csökkentése a máj metabolizmusának befolyásolása révén.

A probiotikus termékek alkalmazása a csecsemıknél kiemelt jelentıséggel bír. A legalapvetıbb probiotikus hatású anyag a csecsemıkorban természetes táplálék, az anyatej, melynek kedvezı immunológiai és szövettápláló hatásai eddig is bizonyítottak voltak [LEVY, 1998; DEWEY és mtsai, 1995], alapvetıen fontos szerepet játszik az újszülöttek még fejletlen immunrendszerének kialakításában [RAUTAVA, 2002]. Az utóbbi évek vizsgálatai kimutatták azt is, hogy az anyatej probiotikus hatású tejsavbaktériumokat tartalmaz, melyek egyértelmően az anyatejtáplálásnak a vastagbél baktérium flórájára gyakorolt kedvezı hatását bizonyítják [LÖNNERDAL, 2000; ROCÍO és mtsai, 2003]. Míg a tápszerrel táplált csecsemık esetében a vastagbélben egy vegyes bélflóra alakul ki nagyobb számú patogén baktérium megjelenése mellett, az anyatejjel táplált csecsemıkben a Bifidus és Lactobacillus [POLGÁR, 2003; DEWEY és mtsai, 1995] flóra kolonizálódik fıként, amely képes a patogén baktériumok elszaporodásának és toxin termelésének a megakadályozására. Ezen kívül közvetlen kedvezı hatást fejt ki az immunrendszerre és szerepe van a fertızı és atópiás megbetegedések megelızésében is. Csecsemıknél a bélben a tápszeres és késıbb a vegyes táplálásra történı átállás során a bifidus flórát vegyes flóra

váltja fel. Egyes megfigyelések arra utalnak [LÖNNERDAL, 2000], hogy a Bifidus és Lactobacillus törzsek visszatelepítésével a bélbe és kolonizálódásának elérésével számos betegségben terápiás hatás érhetı el, ezért életkortól függetlenül jelentıséget kapott az élıflórát tartalmazó tápszerek és élelmiszerek fogyasztása.

Hangsúlyozandó, hogy a probiotikumként alkalmazható mikrobák csak akkor képesek kifejteni hatásukat, ha számukra felhasználható prebiotikus tápanyagok is jelen vannak a vastagbélben.

A jövıben nagy valószínőséggel az ún. szinbiotikumok elterjedése várható. Ezek a pre- és probiotikus hatást ötvözik [BENGMARK, 2003].

2.3. A fruktooligoszacharidok elıállításának enzimatikus lehetıségei

A legtöbb élı szervezet, így a mikroorganizmusok, növények és állatok életmőködései során fellépı különféle biokémiai reakciók lejátszódásáért az élıvilágban meglehetısen nagy számban jelenlévı enzimek a felelısek. A biotechnológia alkalmazása során az ember ezen biokatalizátorokat saját szolgálatába állította.

A biokatalitikus fruktooligoszacharid elıállítási eljárás kivitelezésére alapvetıen kétfajta, egymástól lényegesen eltérı megoldás létezik: inulin részleges hidrolízise inulináz enzimmel, illetve szacharóz átalakítása fruktozil-transzferáz enzimmel. Ez utóbbi során szacharóz (GF) kiindulási anyagból az ún. fruktozil-transzferáz (Ft-áz) enzim segítségével alakítható ki a rövid láncú fruktooligoszacharidok elegye több lépésben. A végtermék elegy a GF2, GF3, GF4 és az át nem alakult szacharóz mellett melléktermékként keletkezı glükózt is tartalmaz. Mivel glükóz a szintézisreakció kompetitív inhibitora, így annak eltávolítása nélkül maximálisan kb. 60 %-os fruktooligoszacharid-koncentráció érhetı el. A glükóz folyamatos eltávolítása a rendszerbıl tehát jelentısen megnövelheti az elıállított termékkoncentrációt.

A fruktooligoszacharidok biokatalitikus szintézisének kivitelezésére alkalmazható enzimek megnevezése sem egységes. Néhány szerzı a hidrolázok csoportjába tartozó β-D- fruktofuranozidázok (EC. 3.2.1.26) elnevezést használja, melynek oka az enzim transzfruktozilációs aktivitásának felfedezésébıl adódik. Ugyanis invertáz mőködését

aktivitásnak a megléte. Míg mások éppen a transzfruktoziláz aktivitásra utalva a fruktozil- transzferázok (EC. 2.4.1.9) elnevezést alkalmazzák, ezzel mintegy kiemelve az enzim nem hidrolitikus voltát [YUN, 1996].

A transzferázok különbözı atomcsoportok átvitelét katalizálják a szubsztrátról egy másik molekulára. Az átvitt csoport lehet foszfát-, szulfát-, metilgyök, cukorrész, aminocsoport, nukleotidrész és más egyéb vegyület is. A transzferázok fontos szerepet töltenek be az erjedési folyamatokban, az aromaképzıdésben, a gyümölcsérésben és sok alapvetı biológiai szintézisben. Az élelmiszer-tudomány számára a legfontosabb transzferázok a következık: foszfo-transzferázok, glükozil-transzferázok, amino- transzferázok, valamint a fruktozil-transzferáz.

4. táblázat: Különbözı mikrobák alkalmazása mellett elérhetı fruktooligoszacharid- hozamok

Forrás

Kiindulási szacharóz- koncentráció

(g dm^-3)

Hozam (%) Hivatkozás

Aspergillus niger AS

0023 500 54 [L'HOCINE és mtsai,

2000]

Penicillium citrinum 700 55 [HAYASHI és mtsai,

2000]

Aspergillus japonicus 400 61 [CHIEN és mtsai,

2001]

Aspergillus oryzae CFR

202 600 58 [SANGEETHA és

mtsai, 2004a]

Aureobasidium pullulans

CFR 77 550 60 [SANGEETHA és

mtsai, 2004b]

Bacillus macerans EG-6 500 33 [PARK, 2001]

Zymomonas mobilis 500-600 24-32 [BEKERS és mtsai,

2002]

A fruktooligoszacharidok mesterséges úton, nagyobb méretekben történı elıállításának lehetséges módja az enzimkatalitikus szintézis, amelyre kétféle lehetıség kínálkozik [YUN, 1996]:

Növényi eredető enzimek alkalmazása: pl. spárga, cukorrépa, hagyma, fokhagyma, articsóka, agavé, cikória enzimei. Ezek szezonális jellege miatt alkalmazásuk kisebb jelentıségő.

A másik, nagyobb enzimhozammal rendelkezı csoportban az enzimforrás bakteriális, illetve gomba eredető: pl. Bacillus macerans, Zymomonas mobilis, Lactobacillus reuteri, Aspergillus sp., Aureobasidium sp., Arthrobacter sp., Fusarium sp., Penicillium sp..

Néhány mikroba alkalmazása mellett elérhetı fruktooligoszacharid-hozamra vonatkozó adatokat tartalmaz a 4. táblázat.

2.3.1. A transzferázok szerepe a fruktooligoszacharidok szintézisében

Az enzimmel katalizált fruktooligoszacharid szintézis reakciómechanizmusa nagyban függ a biokatalizátor eredetétıl. A növények és néhány mikroba esetében több enzim együttes mőködésérıl van szó [YUN, 1996]. Például a csicsóka (Helianthus tuberosus) esetében a folyamat a következıképp alakul [EDELMAN ésDICKERSON,1996]:

Két enzim mőködik együtt: a szacharóz: szacharóz 1-fruktozil-transzferáz (SST) és a β(2→1) fruktán 1-fruktozil-transzferáz (FFT).

SST az elsı lépésben szacharózt alakít át glükózzá és kesztózzá (lásd 1.), majd második lépésben az FFT konszekutív reakció során hoz létre nagyobb tagszámú oligoszacharidokat (lásd 2.).

G F GF GF

GF+ → − + (1)

1

1 +

− + −

−

→

− +

−F_n GF F_m GF F_n GF F_m

GF (2)

Agavé enzimjének a mőködését vizsgálva a következı eredményre jutottak [BHATIA és

G z transzferá fruktozil

F z transzferá fruktozil

GF + − → − − + (3)

z transzferá fruktozil

GF GF z transzferá fruktozil

F− − + → ₂+ − (4)

Hangsúlyozandó, hogy ebben az esetben a glükóz és nem a fruktóz szerepel a szacharózból származó fruktozil-csoport akceptoraként. A képzıdı GF₂, GF₃ és GF₄ molekulák nem mőködhetnek fruktozil donorként, de a magasabb tagszámú oligomerek kialakulása esetén a szacharózból származó glükóz akceptoraként igen.

Egy másik vizsgálat [DICKERSON, 1972] során Claviceps purpurea-ból származó enzim mechanizmusát vizsgálták.

G F G

F G F

G

F2→1 + 2→1 ⇒ 2→6 1←2 + (5)

G F G

F F

F G

F G

F2→1 + 2→6 1←2 ⇒ 2→1 2→6 1←2 + (6)

Ebben az esetben a számok a karbonil-csoportok kapcsolódó szénatomjainak pozícióját, a vékony nyilak pedig a kötés irányultságát jelölik (pl. F2→1G a szacharóz megfelelıje).

Aspergillus niger és Aureobasidium pullulans eredető enzimnél a következı (lásd 7.) reakciómechanizmust találták [YUN, 1996], ahol a képzıdı legnagyobb tagszámú oligomer a GF4.

A reakciómechanizmus szerint a szacharóz diszproporcionálódási folyamatban donorként és akceptorként egyaránt szerepel. Itt külön kiemelendı, hogy ezek az enzimek nagymértékő régióspecificitással rendelkeznek, azaz szelektíven szállítják a szacharózról származó fruktozil-csoportot a másik szacharóz molekula elsı szénatomjára, így kizárólag 1-kesztóz keletkezésével kell számolni.

1

1 +

− +

→

+ _{n n n}

n GF GF GF

GF n=1-3 (7)

Azaz:

Számos fruktozil-transzferáz enzimet izoláltak már [YUN, 1996; SANGEETHA és mtsai, 2005; BEKERS és mtsai, 2002; PARK és mtsai, 2003; EUZENAT és mtsai, 1997]:

általánosságban elmondható, hogy a mikrobiális eredető enzimek nagyobb molekulamérettel és stabilitással, valamint jobb hımérséklet-tőréssel rendelkeznek, mint a növényi eredető társaik.

Az eddig leírt enzimek többsége magas (> 500 g dm^-3) kiindulási szacharóz- koncentráció mellett katalizálja a transzfruktozilációs folyamatot, azaz a fruktooligoszacharidok szintézisét. Ezen szacharóz-koncentráció alatt a hidrolitikus folyamatok lépnek elıtérbe. Fontos megjegyezni, hogy számos, fruktozil-transzferáz enzimet tartalmazó mikroba egyben hidrolitikus, a fruktooligoszacharidok bontását katalizáló enzimet is termel [HAYASHI és mtsai, 1990; PATEL és mtsai, 1994], mindez gyakorlati szempontból meglehetısen elınytelennek bizonyulhat.

Az enzimaktivitás definiálására az irodalomban kétféle lehetıséget találhatunk.

Egyesek 1 U aktivitással jellemzik azt az enzimennyiséget, amely 1 µmol fruktóz egyik molekuláról a másikra történı átvitelét idézi elı 1 perc alatt, míg mások ugyanezt az egy perc alatt képzıdı 1 µmol glükóz keletkezését elıidézı enzim mennyiségével jellemzik

8 GF

4 GF₂

4 G

2 GF₃

2 GF

GF₄

GF₂

[YUN, 1996]. A glükóz mennyiségi meghatározásának egyszerőbb kivitelezhetısége miatt ez utóbbi definíció gyakorlati szempontból elınyösebb.

2.3.2. A hidrolázok szerepe a fruktooligoszacharidok elıállításában

Az elıállítási módok között a biokatalitikus szintézisreakció mellett másik lehetıségként az inulinból történı hidrolitikus bontás lehetısége áll fenn. Az inulin olyan poliszacharid típusú vegyület, DP=10-60, melyben β-2,1 kötésekkel kapcsolódnak össze a fruktózok, a lánc végét egy szacharóz típusú (α-2,1 kötés) glükóz-fruktóz kötéssel lezárva.

Az inulin önmagában is rendelkezik prebiotikus tulajdonságokkal [LÓPEZ-MOLINA és mtsai, 2005]. Adagolása során 1-10 g/nap átlagos mennyiség javasolt. A kezelés alatt a vastagbélben a Bifidobacteriumok, melyek β-1,2-glükozidáz aktivitásuk révén képesek bontani az inulint és Lactobacillusok száma bizonyíthatóan növekedett [VANLOO és mtsai, 1995], 40 g/nap dózis felett azonban már nincs jelentıs további növekedés, nem érdemes ennél nagyobb mennyiségekben alkalmazni. Kísérletek során bizonyították, hogy inulin hatására kb. 30 %-kal növekedett a rövidláncú zsírsavak, ezek közül is elsısorban a propionsav és vajsav koncentráció a vastagbélben (ecetsav, tejsav és egyéb elágazó láncú zsírsavak mennyisége nem növekedett számottevıen) [VAN DE WIELE és mtsai, 2004].

4. ábra: Inulin hidrolízise (G-glükóz, F-fruktóz) (endo-)inulinázzal [RONKART és mtsai, 2007]

F─F─F─F┼F─F┼F─F─F┼ F─F─F┼(F)m┼ F─F─F┼ F─F─F┼ F─F┼F─F─G

F─F─G F─F + F─F

F─F─F + F─F─F + F─F─F + F─F─F F─F─F─F

Fm

Az inulin enzimatikus hidrolízise (endo-)inulináz (E.C. 3.2.1.7.) enzim alkalmazásával hajtható végre, melynek során DP=2-9 tagszámú oligofruktózok, azaz fruktooligoszacharidok és D-fruktóz molekulák keletkeznek (4. ábra) [ROCHA és mtsai, 2006]. A hidrolízist a hidrolázok csoportjába tartozó (exo-)inulináz (EC.3.2.1.80.) enzimmel végrehajtva D-fruktóz szirup elıállítása lehetséges [CATANA és mtsai, 2007].

A gyakorlatban az inulin-típusú oligoszacharidok elıállításának ma már ipari léptékben megvalósított eljárása a csicsókából (Helianthus tuberosus) és a cikóriából (Cychorium intybus) történı hidrolízis. Az ilyen, inulin-típusú oligoszacharid keverékek összetétele azonban szélesebb spektrumú, nagyobb mennyiségben tartalmaz fruktóz- láncokat (F_m) és kis mennyiségben terminális glükózt tartalmazó molekulákat (GF_n). Ezzel szemben a szacharózból kiinduló szintézissel történı elıállítás esetében a jóval homogénebb GFn (n=1-10) összetétellel rendelkezı oligoszacharidok elıállítására van lehetıség, illetve akár egyetlen oligomer-frakció, pl. GF4 elıállítása is lehetséges.

Az összetételnek megfelelıen az inulin-típusú oligoszacharid-elegyek fizikai tulajdonságai is eltérnek a rövid láncú fruktooligoszacharidokétól [NINESS, 1999]. Nagyobb molekulatömegük és lánchosszuk miatt oldatukat nagyobb viszkozitás jellemzi. Rosszabb oldhatóságuk miatt vizes közegben hajlamosak a kristályképzésre, amelynek eredményeképpen állagában a közkedvelt termékekre emlékeztetı (tejszín, vaj, stb.) ízhatás és érzet alakul ki, érzékszervi tulajdonságaik leginkább azokhoz teszik hasonlatossá ıket.

Ezt táplálék-kiegészítıként való alkalmazásukkor érdemes figyelembe venni.

Élettani hatásaikat tekintve az eddigi kutatások során lényeges különbséget nem mutattak ki [RONKART és mtsai, 2007; KOLIDA és GIBSON, 2007]. Mindkét típus rendelkezik a korábban már ismertetett (2.2.1. fejezet) kedvezı prebiotikus tulajdonsággal.

Fiziológiai szempontból mindkét típust az élettanilag kedvezı tulajdonságú élelmi rostok közé sorolhatjuk [GRAHAM ésAMAN, 1986].

2.4. A szimultán termékkinyerés jelentısége összetett biokatalitikus folyamatokban

A biokatalitikus folyamatok során gyakran fellépı probléma, hogy a keletkezı termék, illetve melléktermék inhibitor vagy toxikus hatású az alkalmazott biokatalizátorra (élı sejt vagy enzim) nézve. Erre a problémára jelent megoldást az ún. extraktív biokatalízis [MATTIASON ésLARSSON, 1985; LYE és WOODLEY, 1999; SCHÜGERL, 2000]

alkalmazása, amely során a keletkezı terméket, illetve mellékterméket a képzıdéssel egyidejőleg és lehetıleg szelektíven nyerik ki a rendszerbıl.

A szimultán termékkinyerésnek a termékgátlás hatásának csökkentése mellett további kedvezı hatásai is lehetnek:

• a kedvezıtlen reakció-egyensúly eltolása;

• a termék esetleges bomlásából adódó veszteségek csökkentése;

• a feldolgozási mőveleti lépések számának csökkentése.

Mindezek következménye, hogy az extraktív biokatalitikus rendszerekben a hagyományosakhoz képest:

csökkenthetı a reaktor térfogata;

megtakarítás érhetı el a mind a katalizátor-, mind a szubsztrátköltségeknél.

Az extraktív biokonverziók nem egyszerően két- vagy többlépéses folyamatok, megvalósításukra az integrált rendszerek kialakítása ad lehetıséget. A szimultán termékszeparáció és az ahhoz kapcsolódó további lépéseket több körülmény határozza meg:

a reakció típusa, a biokatalizátor formája (élı sejt vagy enzim, oldott vagy rögzített biokatalizátor), a bioreaktor kialakítása és mőködési módja.

A szubsztrátnak és a termék(ek)nek, illetve melléktermék(ek)nek a biokonverzióval szimultán szeparációjára többfajta módszer alkalmazható [LYE és WOODLEY, 1999] (5.

táblázat).

5. táblázat: A fontosabb szimultán termékszeparációs technikák csoportosítása [LYE és WOODLEY, 1999]

Az elválasztás alapja

(hajtóerı) Lehetséges technikák Megjegyzés

Fizikai tulajdonság

Illékonyság Desztilláció

Gáz-kihajtás Ritkán alkalmazott

Molekulatömeg vagy -méret

Membránok (MF, UF, RO, stb.) Centrifugálás

Méretkizárás Pervaporáció*

A szubsztrát és a termék között gyakran

túl kicsi a különbség

Oldhatóság Extrakció (ATPS, SC is) Kicsapás, kristályosítás

Nagy kapacitás, de általában kis szelektivitás Kémiai tulajdonság

Töltés Hidrofobicitás Kémiai reakció

Elektrodialízis, Ioncsere, Adszorpció, Affinitáson alapuló

módszerek

Nagy szelektivitás, de általában kis kapacitás

* A szeparációs hajtóerık kombinációján alapul.

MF: mikroszőrés; UF: ultraszőrés; RO: fordított ozmózis; ATPS: vizes kétfázisú rendszer; SC: szuperkritikus; HIC: hidrofób-kölcsönhatás kromatográfia

2.4.1. A fruktooligoszacharid szintézis melléktermékének eliminálási lehetıségei

A magas fruktooligoszacharid tartalmú elegyek elıállításának fı hátráltatója a szintézisreakció során fellépı melléktermék, azaz a reakcióban keletkezı glükóz inhibíciója. Eltávolítása nélkül maximálisan 55-60 %-os oligoszacharid-kihozatal érhetı el [YUN és mtsai, 1990]. Ennek következményeképp az ezen a módon iparilag elıállított és kereskedelmi forgalomba kerülı fruktooligoszacharid-elegyek nagy mennyiségben tartalmaznak kiindulási szacharózt és glükózt is. A hatékonyság növelése és kedvezıbb élettani tulajdonságú elegyek elıállítása érdekében érdemes foglalkozni a melléktermék eliminálásának megoldásával.

A glükóz eltávolítására több lehetıség is kínálkozik, például membránszeparáció [SJÖMAN és mtsai, 2007; NISHIZAWA és mtsai, 2000], kromatográfiás elválasztás [VONACH

és mtsai, 1998], vagy enzimatikus eltávolítás. Ez utóbbira példa a glükóz-izomerázzal és glükóz-oxidázzal történı eliminálás [YUN,1996].

A glükóz-izomeráz (EC. 5.3.1.5.) enzim az izomerázok csoportjába tartozik, mőködése során glükózt képes átalakítani fruktózzá. A szakirodalomban talált példa [YUN, 1996] szerint ilyen típusú kevert enzimes rendszerben a glükózra vonatkozó kinetikai állandók (Michaelis-Menten, inhibíciós) kedvezıtlen alakulása révén nem sikerült magasabb fruktooligoszacharid-hozamot elérni.

A glükóz-oxidáz (β-D-glükóz: oxigén 1-oxidoreduktáz, EC. 1.1.3.4) enzim az oxidoreduktázok csoportjába tartozik, egy 160 kDa molekuláris súlyú dimer szerkezető flavoprotein, kofaktorként FAD-ot tartalmaz. Izoelektromos pontja pI=4,2. Mőködése során β-D-glükóz glükonsavvá (D-glükono-1,5-lakton) és hidrogén-peroxiddá történı oxidációját katalizálja, elektronakceptorként molekuláris oxigént használva fel.

2.5. A szilárd fázisú biokatalízis

A biológiai és biokémiai rendszerek alkalmazása során a biotechnológiában is - hasonlóan a vegyiparhoz - az ipari alkalmazhatóság és gazdaságosság követelményei váltak meghatározóvá. Az enzimek immobilizálása a drága biokatalizátorok visszaforgatásának igényével vetıdött fel. Az ötlet már 1915-ben felmerült, azonban akkor még nem tudtak

megfelelıen stabil készítményeket elıállítani. Az 1950-es években azonban ismét elıtérbe került a probléma és 1955-ben Manecke állított elı elsıként megfelelı stabilitású készítményt polimer hordozó alkalmazásával [CAO, 2005].

2.5.1. A rögzített enzimek jelentısége

Az enzimkatalitikus átalakítások megvalósításának két alapvetı módja lehetséges. Az egyik során szakaszos üzemmódban szabad állapotú enzimmel, illetve az enzimet tartalmazó sejttel történik az átalakítás. Általában a nem túlságosan drága és a sejtekbıl könnyebben kinyerhetı extracelluláris enzimeket alkalmazzák ilyen módon, mint például a hidrolázok: amilázok, cellulázok, pektinázok [BALLESTEROS és mtsai, 1994]. A másik esetben valamilyen szilárd fázisú hordozóhoz rögzítetten alkalmazzák a biokatalizátort.

Az enzimek, mint biokatalizátorok valamilyen szilárd fázisú hordozóhoz történı rögzítése több szempontból is elınyös lehet:

• A biokatalizátor könnyebben kezelhetıvé és újrafelhasználhatóvá válik, ami csökkenti az eljárás költségeit;

• Folyamatos üzemmód megvalósítása válik lehetıvé;

• A folyadékfázis által kimosódó biokatalizátor mennyisége minimális;

• A rögzítés gyakran csökkenti az adott készítmény fajlagos aktivitását, azonban ezt ellensúlyozza, hogy az aktív térszerkezet stabilizálása révén a készítmény mőködési stabilitása megnövekszik.

Az immobilizált enzimkészítményeknek alapvetıen két követelménynek kell megfelelniük [CAO, 2005]: egyrészt a nem-katalitikus tulajdonságaikból adódóan, amelyek a környezetüktıl való könnyő elválaszthatóságot, újrafelhasználhatóságot és stabilitást biztosítják számukra; másrészt a katalitikus sajátságaikon keresztül, amelyek egy adott reakció kivitelezésében szükségesek (aktivitás, produktivitás, hozam). Mindezen tulajdonságok folyamatfüggık, azaz az adott reakció, szubsztrát, termék, reaktortípus határozza meg a rögzítés alapanyagát, módszerét és annak körülményeit, ezért kiválasztásuknál mindezekre figyelemmel kell lenni.

2.5.2. Az enzimrögzítés fontosabb típusai

Az enzimek rögzítésére számos, a gyakorlatban is elterjedt módszer ismert. Ezek összefoglalását tartalmazza az 5. ábra.

5. ábra: Az enzimrögzítés fontosabb típusai

Ezek közül az adszorpcióval történı rögzítés talán a legelterjedtebben használt és legegyszerőbb módszer [RANI és mtsai, 2000; DUMITRIU és mtsai, 2003]. Ebben az esetben az enzimmolekulák elsısorban gyenge van der Waals-erıkkel kötıdnek a hordozó felületén, de a kötésben hidrogénhidak és hidrofób kölcsönhatások is részt vehetnek.

Hordozóként szervetlen (alumínium-oxid, titán-hidroxid, bentonit, kalcium-karbonát, agyag, szilikagél, aktív szén, üveg stb.) és szerves (pl. cellulózszármazékok) anyagok is alkalmazhatók. Az adszorpciós rögzítés gyakori hátránya, hogy a gyenge kötıerık következtében a reakció közben bekövetkezı szubsztrát- és ionkoncentráció változások, illetve a hımérséklet-emelkedés hatására deszorpció következhet be.

Az ionos rögzítés az enzim és a hordozó ellentétes töltéső csoportjai közötti elektrosztatikus vonzás révén jön létre [GODJEVARGOVA és mtsai, 2006; JANG és mtsai, 2000]. A kötés erısebb, mint az adszorpció esetében, de gyengébb a kovalens rögzítésnél.

Természetes alapú (pl. cellulóz, dextrán), valamint szintetikus (pl. polisztirol származékok) ioncserélıket alkalmaznak hordozóként. A módszer jelentıs elınye a hordozó

Immobilizálási módszerek

Spontán önadszorpció Irányított (mesterséges) rögzítés

Kereszt - kötés

Hordozóra rögzítés kovalens

kötéssel

Membrán - nal történı elhatárolá s

Mikro - kapszulázás

Gélbezárás