A fumonizineket termelő gombafajok és a fumonizinek in vivo/in vitro

A fumonizinek termelését több fonalas gombanemzetség esetében is megfigyelték, azonban a fő fumonizin-termelők a F. verticillioides és a F. proliferatum, amelyek világszerte elterjedt patogén fajai gazdaságilag fontos növényfajoknak, különösen a kukoricának, és emiatt számos országban jelentős élelmiszerbiztonsági problémát okoznak.

A Fusarium fajokat a gomba taxonómiával foglalkozó kutatók a morfológiai bélyegek alapján több szekcióba sorolják. Egyre elterjedtebben alkalmazzák a DNS-alapú eljárásokat is a fajok azonosítására és a fajpopuláció genetikai változékonyságának a kimutatására. A szakirodalom négy szekció (Liseola, Dlaminia, Elegans, Arthrosporiella), összesen 15 faja (1. táblázat) esetén említi, hogy képesek fumonizineket szintetizálni, azonban nem egyforma mértékben (Rheeder és mtsai 2002). A legtöbb fumonizin-termelő Fusarium faj esetében az FB₁ toxin mennyisége a legjelentősebb, az összfumonizin-tartalom kb. 70-80%-a. Az FB2 és az FB3 toxinok mennyisége 15-25% illetve 3-8% között változik, míg az FB₄ mennyisége általában nem jelentős (Thiel és mtsai 1992; Marín és mtsai 1995; Musser és Plattner 1997). A Fusarium fajok – így a fumonizin-termelésre képesek is – a szántóföldi penészekhez tartoznak, azaz már a szántóföldön megfertőzik a gazdanövényt és kedvező körülmények esetén a raktározás alatt is folytatják a mikotoxinok bioszintézisét. A fumonizin-termelés szempontjából az abiotikus tényezők közül a nedvesség-tartalomnak és a hőmérsékletnek van a legnagyobb jelentősége. Le Bars és mtsai (1994) kimutatták, hogy 22% nedvesség-tartalom alatti szubsztráton nem történik fumonizin-termelés. Több közlemény szerint a szántóföldi körülmények között történő fumonizin bioszintézis 30-32% nedvesség-tartalom és 20-25 °C hőmérsékleten a legoptimálisabb (Le Bars és mtsai 1994; Nelson és mtsai 1994). Marín és mtsai (1996, 1999) szerint a F. verticillioides és a F. proliferatum fumonizin-termelése szempontjából a 0,97-es vízaktivitás (aw) és a 15-30 °C hőmérséklet az optimális.

A fumonizinek bioszintézisét számos Fusarium faj mellett néhány egyéb gombanemzetség esetében is megfigyelték. A fumonizinek termelésére képes gombafajok és az általuk szintetizált fumonizinek – Rheeder és mtsai (2002) összefoglaló közleményét a legújabb eredményekkel kiegészítve – az 1. táblázatban láthatók. A paradicsom egyik kórokozója az Alternaria alternata esetében leírták, hogy in vitro képes termelni fumonizineket (Chen és mtsai 1992; Abbas és Riley 1996; Mirocha és mtsai 1996), azonban 1996 után ezen faj fumonizin-termelőképessége a paradicsom esetében nem nyert megerősítést.

1. táblázat. Fumonizineket termelő fonalas gombafajok (MP „mating population”,

verticillioides-hez hasonlóan a fumonizinek bioszintéziséért felelős génklasztert sikerült ebben a fajban is azonosítani és táptalajon fumonizint (FB₂) termeltetni (Frisvad és mtsai 2007). Ezen megfigyelések után az A. niger fumonizin-termelésével kapcsolatos kutatások

felgyorsultak és sikerült kávébabban (Noonim és mtsai 2009), szőlőben (Logrieco és mtsai 2009; Mogensen és mtsai 2010a), mustban (Logrieco és mtsai 2009), borban (Mogensen és mtsai 2010b) és mazsolában (Mogensen és mtsai 2010a) is fumonizineket azonosítani. A F. verticillioides és az A. niger fumonizin bioszintézist szabályozó gén klasztereit a bioszintézissel foglalkozó fejezetben részletesebben ismertetem. Legújabban Mogensen és mtsai (2010c) Tolypocladium fajokkal kapcsolatban mutatták ki, hogy képesek fumonizineket (FB2, FB4) szintetizálni. A fumonizin bioszintézis szabályozásáért felelős génklaszter egymástól viszonylag távolálló nemzetségekben történő megjelenése is felveti a fajok és nemzetségek közötti horizontális géntranszfer lehetőségét.

A fumonizinek állatetetési kísérletekben történő alkalmazásához, a toxicitás és az in vivo metabolizmus vizsgálatához viszonylag nagy mennyiségű toxinra van szükség. A kereskedelmi forgalomban kapható fumonizinek igen drágák, ezért az állatkísérletekhez a fumonizineket lehetőleg in vivo vagy in vitro kell a toxinogén gombafajokkal megtermeltetni és lehetőség szerint a felhasználás előtt preparatív módszerekkel a biológiai mátrixból kinyerni azokat (ezekhez a kísérletekhez nem szükséges az analitikai tisztaságú komponens). Szántóföldi, természetes fertőződésből származó kukorica esetében 2-3 g/kg fumonizin produkció érhető el. Az in vivo fumonizin-termeltetés hátránya, hogy a biotikus és abiotikus tényezők változékonysága miatt homogén fumonizin eloszlást nem lehet elérni, és a termeltetés körülményeinek a standardizálása is nehézségekbe ütközik. Ezen okok következtében a fumonizinek termeltetésére az in vitro eljárások jobban elterjedtek.

A fumonizinek in vitro termeltetése szempontjából az abiotikus faktorok (vízaktivitás, hőmérséklet) mellett igen nagy jelentősége van a termeltetés szubsztrátjának és az alkalmazott izolátumnak, mint biotikus faktoroknak is. Mivel a toxintermelést jelentősen befolyásolja az alkalmazott gombafaj és izolátum (Musser és Plattner 1997), igen fontos, hogy a lehető legnagyobb toxin-kihozatalhoz a rendelkezésre álló fajok és izolátumok közül a legmegfelelőbbet válasszák ki. A termeltetéshez leggyakrabban F. verticillioides és F. proliferatum izolátumokat alkalmaznak. Ezeknek a fajoknak számos izolátuma termel fumonizint, azonban sok izolátum csak nyomnyi mennyiségű fumonizint szintetizál (Rheeder és mtsai 2002). Kétségkívül, a ma fumonizin-termeltetésre használt izolátumok közül a legismertebb a Dél-Afrikában izolált MRC 826-os elnevezésű F. verticillioides izolátum. A fumonizinek in vitro termeltetésére folyadék- és szilárd tenyészeteket is alkalmaznak. A folyadékkultúra előnye az, hogy a termeltetést követően kevesebb zavaró mátrix komponenst tartalmaz. A folyadékkultúrás termeltetés során gyakran valamilyen természetes-eredetű tápoldat kiegészítőt (pl. élesztőkivonat, kukoricaliszt, cirokliszt,

rizsliszt, keményítő kivonat) alkalmaznak az optimális fumonizin-termeléshez (Narashima Rao és mtsai 2010). Jiménez és mtsai (2003) kimutatták, hogy a csak ásványi sókat, vizet és egy-egy cukrot és aminosavat tartalmazó tápoldatban a Gibberella fujikuroi fajkomplex izolátumai szerves-eredetű tápoldat kiegészítő (élesztőkivonat, keményítő kivonat, mikológiai pepton) nélkül nem voltak képesek növekedni. A tápoldat kiegészítők alkalmazása mellett a cukorszint növelésével (5, 10 és 20 g/l) a termelt FB1 és FB2 toxinok mennyisége is növekedett. A tápoldat összetevőinek optimalizálásával az egyik izolátumnál az FB1 és FB2 esetében 6,609 és 1,472 μg/ml koncentrációt sikerült elérniük.

Azt is megállapították, hogy a cukor-aminosav-izolátum kombináció alapvető jelentőségű a fumonizin bioszintézis szempontjából, azaz minden egyes izolátum esetében optimalizálni kell a tápoldathoz adagolt szén- és nitrogénforrás mennyiségét is. A tápoldathoz adott aminosavak (mint szerves nitrogénforrás) koncentrációjának 1 g/l értékről 10 g/l értékre növelése a fumonizinek bioszintézisét csökkentette, ami igazolta Shim és Woloshuk (1999) eredményeit, miszerint a F. verticillioides esetében nitrogénbőség esetén a fumonizin bioszintézis út gátolt, nitrogénhiány viszont indukálja a toxintermelést. Hornok László akadémikus kutatócsoportja közölte, hogy a nitrogénhiányra fellépő fumonizin bioszintézist a FUM gének (FUM1 és FUM8) transzkripciós aktivációja váltja ki. Vad típusú, ΔFphog1 MAPK null-mutáns és a vad típusú alléllal komplementált MAPK mutáns törzsekkel végzett kísérleteikben igazolták, hogy a nitrogénhiány-okozta stressz érzékelésben az Fphog1 MAP kináz igen fontos szerepet játszik (Ádám és mtsai 2008a,b; Kohut és mtsai 2009).

A fumonizinek termeltetéséhez a szilárd tenyésztési eljárásokat gyakrabban alkalmazzák mivel a viszonylag egyszerűbb eljárással jelentősebb mennyiségű fumonizin állítható elő. Szubsztrátként általában kukoricát vagy rizst használnak fel a termeltetéshez.

Az MRC 826-os izolátummal Alberts és mtsai (1990) szemes kukoricán 17900 mg/kg FB1

toxint tudtak termeltetni. Eredményeiket – ugyanazt az izolátumot alkalmazva – Fodor és mtsai (2006) nem tudták reprodukálni. Kísérleteikben az FB1 toxin tekintetében jóval alacsonyabb (244,4 ± 102,5 mg/kg) toxinhozamot értek el, feltehetőleg azért mert szemes kukorica helyett darált kukoricát alkalmaztak és a tenyészetek a nem megfelelő szellőzés miatt befülledtek és/vagy az izolátum fenntartása során az izolátum fumonizin-termelőképessége a többszöri átoltás miatt lecsökkent. Hinojo és mtsai (2006) F.

verticillioides izolátummal rizsen 3840 mg/kg FB₁ és 448,5 mg/kg FB₂ toxint tudtak termeltetni. A fumonizin-termelés 20 °C hőmérsékleten volt a legmagasabb, míg 37 °C-on

a legalacsonyabb. Az öt vizsgált vízaktivitás (a_w) értékből négynek (0,97; 0,98; 0,99 és 1,0) nem volt szignifikáns hatása a fumonizin-termelésre, viszont 0,96-os a_w érték alatt fumonizineket nem tudtak kimutatni a tenyészetekből. Bailly és mtsai (2005) egész szemű, durva szemcseméretűre, valamint liszt finomságúra őrölt kukoricát és rizst használtak szubsztrátként erősen toxinogén F. verticillioides izolátumok fumonizin-termelésének a tanulmányozásához. A kukorica szubsztráton a rizs szubsztráthoz képest magasabb FB1

szintet értek el, ugyanakkor a két szubsztrát között a micélium növekedésben – az ergoszterin-tartalom meghatározása alapján – szignifikáns eltérést nem tapasztaltak. A legmagasabb toxin hozamot (4000 mg FB1/kg) az NRRL-3428-as számú izolátummal a durvára őrölt kukorica esetében kapták, amikor 50% víztartalom mellett, 5 hétig, 21 °C hőmérsékleten inkubálták a tenyészeteket. A durvára őrölt kukorica esetében a gomba micéliumok könnyebben hozzáfértek a makro- és mikroelemekhez, szerves tápanyagokhoz, mint a szemes kukorica esetében. A kukoricaliszt szubsztráton a gyenge oxigén ellátottság miatt a micéliumok nem tudtak megfelelő mértékben növekedni, ami minimális fumonizin-termelést eredményezett.