3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
3.6. A fumonizinek minőségi és mennyiségi meghatározása
3.6.2. F. verticillioides izolátumok FB 1-4 toxinprofiljának meghatározása RP-HPLC/
A különféle F. verticillioides izolátumok FB1-4 toxinprofiljának meghatározásához a GK Kft. HPLC/ESI–ITMS készülékén is a meredekebb grádiens HPLC elválasztást alkalmaztuk. A készülékegyüttes egy Hewlett-Packard 1090 Series II típusú folyadékkromatográfot és egy Varian 500-ITMS (Varian, Inc., Walnut Creek, CA, USA) tömegspektrométert tartalmazott (8. ábra), amely ESI ionforrással volt felszerelve és amelyet szintén pozitív ion módban üzemeltettünk. A HPLC készülék beépített bináris pumpával, automata mintaadagolóval és kiegészítésként egy „Varian Prostar” típusú vákuumos oldószer gáztalanítóval volt felszerelve. A HPLC mérési paraméterek (oszlop típusa, oldószerek, grádiens meredekség, oszloptermosztát és hőmérséklete, áramlási sebesség, injektált minta térfogata) – a HPLC készülék típusát kivéve – mindenben megegyeztek a fent leírtakkal. A Varian 500-ITMS készülék mérési paraméterei az alábbiakban láthatók. ESI paraméterek: porlasztógáz (N2) nyomása, 60 psi; szárítógáz (N2) nyomása és hőmérséklete, 20 psi és 350 °C; porlasztócsúcs feszültsége, 4000 V; kapilláris feszültsége, 139 V; „spray” pajzs feszültsége, 600 V; Ionizációs kontroll paraméterek:
„target” TIC, 100%; max ion idő, 500000 µs; Pásztázási paraméterek: tömegtartomány, m/z 500-850; RF terhelés, 82%. Általános paraméterek: pásztázási idő, 2,05 ms; spektrum átlagolás, 3 µScans; adatgyűjtési frekvencia, 0,49 Hz. A tömegspektrométer paramétereinek az optimalizálásához az FB1 toxin oldatát (1 ng/µl, MeOH/H2O 1/1, v/v + 0,1% HCOOH) a készülék beépített fecskendőpumpájának a segítségével juttattuk be az ionforrásba (5 µl/perc) áramlási injektálásos (FIA) módszerrel. A mennyiségi kiértékelést külső standard módszerrel végeztük az FB1-4 toxinok oldatainak (10 pg/µl – 500 ng/µl)
felhasználásával. A HPLC/ESI–ITMS rendszer szabályozását és a tömegspektrometriás adatok kiértékelését az Agilent ChemStation szoftver (A09.03) és a Varian Workstation 6.6 (SP1) szoftver végezte (Szécsi és mtsai 2010).
3.6.3. Új fumonizin izomerek RP-HPLC/ESI–ITMS és TOFMS módszerrel történő meghatározása kevésbé meredek grádiens elválasztás felhasználásával
Miután a fumonizin vizsgálatok első 4 évében számos új fumonizint sikerült azonosítani a fent említett meredekebb grádiens HPLC elválasztás alkalmazásával, a GK Kft. laboratóriumába beszerzett, a gyártó által szerkezeti izomerek elválasztására javasolt HPLC oszloppal új, kevésbé meredek grádiens elválasztást dolgoztunk ki. Ezt a HPLC oszlopot és kevésbé meredek grádienst alkalmaztuk később az ELTE EKOL laboratóriumában a fumonizin izomerek RP-HPLC/ESI–TOFMS meghatározása során is.
Az ELTE EKOL laboratóriumának HPLC/ESI–TOFMS készüléke az 9. ábrán látható.
9. ábra. Az ELTE EKOL laboratóriumának HPLC/ESI–TOFMS készüléke.
A fumonizin izomerek kevésbé meredek grádienssel történő HPLC elválasztása és tömegspektrometriás meghatározása során alkalmazott mérési paraméterek az alábbiakban olvashatók. A Varian 500-ITMS ioncsapda tömeganalizátorral ellátott tömegspektrométerhez egy Hewlett-Packard 1090 Series II típusú HPLC készüléket – beépített bináris pumpával, és automata mintaadagolóval – csatlakoztattunk (8. ábra). A HPLC elválasztást YMC-Pack J’sphere ODS H80 (250 x 2,1 mm, 4 µm) RP-HPLC oszlopon (YMC Europe GmbH, Dinslaken, Németország) végeztük, amely a holttérfogatok csökkentése miatt a fentiekben már említett Jones „7990 Space” típusú oszloptermosztátba volt helyezve, amelyet 40 °C hőmérsékletre állítottunk. A bináris
grádiens elválasztáshoz „A” (H2O + 0,1% HCOOH) és „B” (MeCN + 0,1% HCOOH) oldószerek grádiensét alkalmaztuk. A minta (1 μl) injektálásakor a grádiens 24% „B”
értékről indult és 79 perc alatt lineárisan emelkedett 40% „B” értékig, majd további 15 perc alatt 100% „B”-re emelkedett, amely 10 percig tartott. Az áramlási sebesség 0,2 ml/perc volt.
Az elválasztott fumonizineket pozitív ion MS és MSMS módban, normál pásztázási sebességgel detektáltuk a Varian 500-ITMS készülékkel. A műszer fontosabb mérési paraméterei a következők voltak. ESI paraméterek: porlasztókamra hőmérséklete, 55 °C;
porlasztógáz (N2) nyomása, 60 psi; szárítógáz (N2) nyomása és hőmérséklete, 20 psi és 350
°C; porlasztócsúcs feszültsége, 4000 V; „spray” pajzs feszültsége, 600 V. Általános paraméterek: maximum pásztázási idő, 2,71 ms; spektrum átlagolás, 3 spektrumonként;
adatgyűjtési sebesség, 0,37 Hz; max ion idő, 500000 μs. MSMS paraméterek: kapilláris feszültség, 139 V; RF terhelés, 75%; ion izolálási ablak, 3 m/z; hullámforma típusa, rezonáns; gerjesztési amplitúdó, 2,83 V; gerjesztési idő, 10 ms. A fenti ESI paramétereket FB1 referencia oldat (1 ng/μl, MeCN/H2O 1/1, v/v + 0,1% HCOOH) ionforrásba juttatásával (5 μl/perc) optimalizáltuk a tömegspektrométerbe épített fecskendőpumpa felhasználásával. A F. verticillioides izolátumokkal fertőzött rizstenyészet minták mennyiségi kiértékelését az FB1 toxin kalibrációs mintái (10 pg – 1000 ng az oszlopra injektálva) alapján külső standard módszerrel végeztük és az eredményeket a fő komponens, az FB1 toxin százalékában adtuk meg. A teljes HPLC/ESI–ITMS rendszer szabályozását és a tömegspektrometriás adatok kiértékelését az Agilent ChemStation szoftver (A09.03) és a Varian Workstation 6.6 (SP1) szoftver végezte.
A fumonizin izomerek HPLC/ESI–TOFMS vizsgálatához Agilent 1200 típusú moduláris HPLC rendszert és Agilent 6210 típusú ESI–TOFMS készüléket használtunk, amely nagypontosságú tömegmérésre alkalmas tömegspektrométer. A HPLC készülék mikro vákuumos oldószer gáztalanítót, bináris pumpát és automata mintaadagoló modulokat tartalmazott. Oszloptermosztátként a korábban már említett Jones gyártmányú készüléket alkalmaztuk (40 °C), amelyet az összekötő kapillárisok (0,127 mm ID) hosszának minimalizálása céljából térben az injektor szelep és az ESI ionforrás porlasztója közé helyeztünk. A bináris pumpából a pulzálást csökkentő egységet kivettük abból a célból, hogy csökkentsük az oldószerszállító rendszer holttérfogatát, mivel a fentiekben említett HPLC/ESI–ITMS méréseknél alkalmazott HP 1090 Series II típusú folyadékkromatográf oldószerszállító rendszerének a holttérfogata jóval kisebb volt. A pulzálást csökkentő egység eltávolításával sikerült hasonló retenciós időket kapnunk a
kétféle rendszerrel, bár még így is a HPLC/ESI–ITMS méréseknél valamivel alacsonyabbak voltak a retenciós idők. A többi HPLC mérési paraméter (HPLC oszlop, oldószer-összetétel, grádiens meredekség, áramlási sebesség, injektálási térfogat) az előbb említett HPLC/ESI–ITMS méréseknél alkalmazottakkal megegyezett. Az ESI–TOFMS készülék fontosabb mérési paraméterei a következők voltak: 2 porlasztót tartalmazó ESI ionforrás, amelynél az egyik porlasztón keresztül a HPLC oszlopról az oldószerárammal eluálódó komponenseket, míg a másik porlasztó segítségével a pontos tömeg méréséhez nélkülözhetetlen két referencia tömeget (m/z 121,050873 és 922,009798) tartalmazó oldatot juttattuk be az ionforrásba; porlasztógáz (N2) nyomása, 20 psi; szárítógáz (N2) sebessége és hőmérséklete, 10 l/perc és 350 °C; kapilláris feszültsége, 3500 V; fragmentor feszültsége, 170 V; „skimmer” lencse potenciálja, 70 V; „OCT 1 RF Vpp”, 250 V;
pásztázási tömegtartomány, m/z 100-1700, adatgyűjtési sebesség, 250 ms/spektrum. A HPLC/ESI–TOFMS készüléket az Agilent ChemStation B03.02 szoftver vezérelte és az adatokat az Agilent MassHunter B.02.00 szoftverrel dolgoztuk fel.
3.6.4. Mazsola- és vöröshagymaminták fumonizin-tartalmának és mazsoláról izolált