Különféle termőhelyeken, különféle növényfajokról (főként kukorica) és egyéb forrásokból begyűjtött és azonosított összesen 60 F. verticillioides izolátummal termeltettünk fumonizineket szilárd fermentációval, rizstenyészetben. Viszonylag meredek grádiens RP-HPLC elválasztás után ESI–ITMS eljárással detektáltuk az FB1-4 toxinokat. A vizsgálatok alapján megállapítottuk, hogy mindegyik izolátum termelt fumonizineket és az izolátumok közel 50%-a jelentős mennyiségű FB1-4 toxint termelt. Sem az FB1-4-termelés mennyiségét, sem a négy FB analóg egymás közötti arányát az izolátum eredete nem befolyásolta. Az izolátumok többségénél (85%) a termelt teljes FB1-4 mennyiségének átlagosan 75 %-a FB1, 18 %-a FB2, 5 %-a FB3, 2 %-a FB4 volt. Az izolátumok kisebb része (12%) jelentősebb mennyiségben termelte az FB3 toxint, míg két izolátum a többitől lényegesen eltérő arányban termelte az FB2 és FB4 toxinokat, így feltételezhetjük, hogy Magyarországon a F. verticillioides legalább két különböző kemotípusa kíséri a kukoricanövényt (Szécsi és mtsai 2010). Együttműködésben végzett kutatásunk először térképezte fel Magyarországon a F. verticillioides elterjedését.
Az előkísérletek alapján kiválasztott rizstenyészet kivonatának – meredekebb grádienst alkalmazó – RP-HPLC/ESI–ITMS és ITMS2 vizsgálata során, korábban már publikált fumonizinek mellett, 41 új fumonizint és fumonizin izomert azonosítottunk (Bartók és mtsai 2006, Bartók és mtsai 2008). A fő komponens (FB1) 0,02%-ában a mintában jelenlévő fumonizinekről még jellemző – az azonosításukat segítő – MS2 spektrumokat sikerült nyerni. A molekulaionok MS2 spektruma alapján a különböző fumonizin analógokra részletes fragmentációs útvonalakat vázoltunk fel (köztük újakat is). A számos új fumonizin közül ki kell emelni az FD-t és az FBX analógokat.
Az FD toxin esetében a szénlánc – az eddig publikált fumonizinekhez képest – kevesebb atomot tartalmaz, ami valószínűsíti, hogy a hosszabb szénláncú komponensek prekurzora lehet. A 16 új FBX analógnál a fumonizin vázon lévő OH-csoportok közül egyet vagy kettőt nem a trikarballilsav, hanem egyéb szerves sav (cisz-akonitsav, oxálfumársav, oxálborostyánkősav) észteresít. Ezt a fumonizin csoportot az FB analógokhoz hasonló szerkezetük miatt neveztük el FBX-nek. Az FBX-típusú fumonizinek illetve fumonizin prekurzorok azonosításával igazoltuk a fumonizinek trikarballil-csoportjai citrát-ciklus eredetét, mivel a TCA az előbb említett szerves savakból egy-két enzimatikus lépéssel kialakulhat.
A fumonizin izomerek HPLC elválasztására a korábban közölteknél hatékonyabb módszert dolgoztunk ki, egy – a gyártó által szerkezeti izomerek elválasztására javasolt – RP-HPLC oszlop és a korábban alkalmazotthoz képest kevésbé meredek grádiens elúció felhasználásával. Ezzel az oszloppal az FB1 és FB5 toxinok 28 (Bartók és mtsai 2010a) valamint 22 izomerjét (Bartók és mtsai 2011a) sikerült elválasztani és ESI–ITMS valamint ESI–TOFMS eljárásokkal azonosítani F.
verticillioides izolátummal fertőzött rizstenyészet kivonatából. Az FB1 és az FB5
izomerek molekulaionjai ITMS2 spektrumaiban 15 és 20 jellemző fragmension volt megfigyelhető, köztük az azonosításukat megkönnyítő, a CID fragmentáció végén visszamaradó szénhidrogén váz is (m/z 299 és m/z 297). Az FB1- és FB5 izomerek FB1
toxin-tartalomra vonatkoztatott relatív mennyisége 0,001 és 0,579% valamint 0,001 és 0,304% között volt. Három FB1 és öt FB5 toxin izomer fordult elő viszonylag nagyobb mennyiségben. Esetükben nyílik lehetőség a szerkezetvizsgálathoz szükséges mennyiségű és minőségű anyag előállítására. A pontos tömeg meghatározására alkalmas TOFMS eljárást kutatócsoportunk alkalmazta először fumonizin izomerek azonosítására. A pontos tömegmérés alapján a TOFMS készülék „Mass Hunter” szoftvere mindegyik FB1 és FB5 izomer esetén az első helyen javasolta a C34H59NO15 és C34H59NO16 tapasztalati képleteket.
Az ESI–ITMS és ESI–TOFMS készülékekkel – a kevésbé meredek grádiens HPLC elválasztást alkalmazva – hat (2-2-2 izomer) új, a korábban közölteknél magasabb molekulatömegű fumonizint is azonosítottunk (Bartók és mtsai 2010b). A HPLC elválasztás során ezek a fumonizinek közel 100% MeCN-nel (0,1% HCOOH-val kiegészítve) eluálódtak a C18-as állófázist tartalmazó HPLC oszlopról, jelezve, hogy az addig közölt fumonizineknél jóval apolárisabbak. Az ITMS spektrumok egyértelműen mutatták az apoláris fumonizinek molekulaionjai m/z értékét (960, 984, 986). A molekulaionok CID-MS spektrumaiban található fragmensionok m/z értéke (beleértve a szénhidrogén váz 299-es m/z értékét is) jelezte, hogy a magas molekulatömegű fumonizinek szerkezete az FB1 toxinéhoz hasonló, kivéve azt, hogy további funkciós csoport is található a molekulájukban. A TOFMS műszerrel mért pontos tömegértékek alapján a kiértékelő szoftver az új komponensek esetében egyértelműen jelezte a C50H89NO16, C52H89NO16 és C52H91NO16 tapasztalati képleteket a hozzájuk tartozó számított pontos tömegértékekkel együtt (960,6254; 984,6254 és 986,6411). Ezekből a tapasztalati képletekből – az FB1 toxin tapasztalati képlete segítségével – sikerült azonosítani a fumonizin vázon lévő harmadik acil-csoportokat (palmitil, linolil vagy
oleil), azaz esetükben feltehetően a fumonizin váz egyik OH-csoportját palmitinsav, linolsav és olajsav észteresíti, vagy ezek a szerves savak – hasonlóan a ceramidokhoz – a primer amino-csoporttal képeznek savamidot. A fumonizin irodalomban jelenleg alkalmazott elnevezéseket (pl. FB1, PHFB1 = részlegesen hidrolizált FB1; HFB1 = hidrolizált FB1) figyelembe véve az új fumonizineket észterezett FB1 toxinoknak (EFB1) neveztük el. A nevük végén található két betű utal a harmadik szerves savra (EFB1 PA, izo-EFB1 PA, EFB1 LA, izo-EFB1 LA, EFB1 OA és izo-EFB1 OA). A harmadik acil-csoport miatt ezek a vegyületek a többi, poláris karakterű fumonizinhez képest eltérő, erősebb biológiai hatással (toxicitással) rendelkezhetnek.
Szintén a kevésbé meredek grádiens elválasztást alkalmazva a mások által közölt FP1-3 toxinokon kívül öt új FP analógot, az FP4 toxint és négy FP izomert (izo-FP1-4) sikerült kimutatnunk a vizsgált rizstenyészet kivonatban (Bartók és mtsai 2011b). Az új FP analógok létezését az alábbi kísérleti adatok támasztották alá: 1) azonos kromatografálási körülmények között nyert retenciós idők, összehasonlítva azokat a már ismert FB1-4 és FP1-3 vegyületek retenciós idejével és az FB1 toxinra vonatkoztatott relatív retenciókkal; 2) ESI–TOFMS mérés során kapott pontos tömeg adatok; 3) ESI–ITMS2-el nyert CID-MS spektrumok és fragmentációs mintázat. Az FP1-4 toxinok retenciós idő szerinti sorrendje (FP1 < FP3 < FP2 < FP4) megegyezett az FB1-4 toxinok sorrendjével (FB1
< FB3 < FB2 < FB4). Ezek az elúciós sorrendek segítették az FP4 vegyület azonosítását a TOFMS és az ITMS eljárással is.
Különböző országokból származó mazsolaminták fumonizin-tartalmát és a mazsolákról izolált fekete Aspergillus fajok táptalajon történő fumonizin-termelését vizsgáltuk. Összesen 72, mazsoláról származó fekete Aspergillus izolátum ITS régiójának PCR–RFLP analízise, valamint a kalmodulin gén egy szakaszának szekvencia analízise alapján 30 izolátum tartozott az A. niger és A. awamori fajhoz, közülük az RP-HPLC/ESI–
ITMS analízis alapján 20 termelt táptalajon átlagosan 5,16 mg/kg fumonizint. A korábban A. niger-ben azonosított FB2, FB4 és izo-FB1 (FB6) toxinok mellett kimutattunk néhány olyan fumonizin izomert is – legtöbbjüket nyomnyi mennyiségben – melyeket korábban Aspergillus fajokban nem detektáltak (pl. FB1, FB3, 3-epi-FB3, 3-epi-FB4). A mazsolaminták átlagos fumonizin-tartalma 7,22 mg/kg volt, ami közel kétszerese az EU-ban feldolgozatlan kukoricára érvényes egészségügyi határértéknek (4 mg/kg). Egy Kaliforniából származó mintában közel 36 mg/kg összfumonizin-tartalmat mutattunk ki, ami kilencszerese az előbb említett határértéknek. A mazsolából és a fekete Aspergillus fajokkal fertőzött táptalajmintákból készített kivonatok RP-HPLC/ESI–ITMS analízise
során a speciális HPLC oszloppal és kevésbé meredek grádiens elválasztással először mutattuk be biológiai mintából a 3-epi-FB4 és FB4 toxinok elválasztását. Ezzel az elválasztással felhívtuk a figyelmet arra, hogy biológiai mintákból a 3-epi-FB3 és FB3
valamint a 3-epi-FB4 és FB4 toxinok csak megfelelő hatékonyságú HPLC oszloppal, kevésbé meredek grádiens, esetleg izokratikus analízissel választhatók el egymástól (Varga és mtsai 2010). Fentiek alapján valószínűsíthető, hogy szükség lehet – amennyiben a további vizsgálatok hasonló eredményeket hoznak – azon magas cukortartalmú élelmiszerek (pl. mazsola, füge, datolya, aszalt gyümölcsök) esetében is határérték megállapítására, amelyeket a fekete Aspergillus fajok képesek megfertőzni és a szubsztrátban fumonizineket szintetizálni.
A Magyarországon kiskereskedelmi forgalomban vásárolt penészes vöröshagymaminták (6 db) külső száraz és belső húsos burokleveleinek mikobióta vizsgálata azt mutatta, hogy egy kivételével az összes minta fekete Aspergillus fajokkal volt fertőződve. Fajszintű besorolásukat a kalmodulin gén egy szakaszának szekvencia analízisével végeztük el. Az izolátumok szekvencia-alapú vizsgálata alapján megállapítottuk, hogy mind a 35 izolátum az A. awamori fajhoz tartozott. Két minta 0,3 mg/kg koncentrációban volt szennyezve fumonizinekkel. Az izomerek közül izo-FB1-et (FB6), FB2-4-et, 3-epi-FB4-et, és egy izo-FB2,3 formát azonosítottunk. Érdekes megfigyelés, hogy az egyik mintában a 3-epi-FB4 mennyisége valamivel meghaladta az FB4 toxin mennyiségét, míg a másik fumonizin-tartalmú mintában a 3-epi-FB4-et nem tudtuk kimutatni. A szekvencia és a fumonizin összetétel vizsgálatok alapján valószínűsíthető, hogy a Magyarországról származó vöröshagymák feketepenészes rothadásáért és fumonizin-szennyezéséért az A. awamori a felelős (Varga és mtsai 2011).
6. TOVÁBBI FELADATOK, LEHETŐSÉGEK A FUMONIZIN KUTATÁSBAN AZ