Fumonizinek RP-HPLC/ESI–ITMS azonosítása vöröshagymában

Összesen hat fertőzött (A-F) – a feketepenészes rothadás tüneteit is mutató – és egy kontroll (nem fertőzött, G) vöröshagymamintát (48. ábra) vizsgáltunk meg. A „D” minta kivételével – amelyből A. fumigatus-t, A. versicolor-t és Penicillium fajokat izoláltunk – a vöröshagymák külső és belső rétegeiből is sikeresen izoláltunk fekete Aspergillus fajokat (49. ábra).

48. ábra. A vizsgált fertőzött (A-F) és kontroll (G) vöröshagymaminták (Bartók Tibor felvétele).

A fekete Aspergillus fajok mellett egyéb Aspergillus fajokat is izoláltunk, úgymint: A.

ochraceus (A és C minták), A. fumigatus (B minta) és A. flavus (E és F minta).

A B

C D

E F

49. ábra. Vöröshagymaminták mikobiótája DRBC táptalajon. (Kocsubé Sándor felvétele).

Az 5 mintáról (A, B, C, E, F) összesen 38 fekete Aspergillus izolátumot nyertünk.

Ezeknek a mintáknak amplifikáltuk az ITS régióját, majd RsaI restrikciós enzimmel emésztettük a kapott fragmenteket. Az emésztést követően – a mazsolánál már leírtakhoz hasonlóan – az eltérő RFLP-mintázatok alapján a fekete Aspergillus törzsek két csoportját

különböztettük meg: N-mintázatot az A. niger, T-mintázatot pedig az A. tubingensis izolátumok esetében lehetett megfigyelni. Az A. niger ITS régiója tartalmazza az RsaI (5’-GT/AC-3’) felismerési helyét a 75-ös pozíciónál, míg az A. tubingensis nem. Vizsgálataink alapján az izolátumaink közül 35 mutatott „N”-típusú PCR–RFLP-mintázatot.

Az izolátumok fajszintű besorolásához a fekete Aspergillus izolátumok kalmodulin génje egy szakaszának szekvencia analízisét alkalmaztuk (Samson és mtsai 2007). Az evolúciós kapcsolatokat a „Maximum Parsimony” módszer segítségével ábrázoltuk. A kalmodulin génszakaszok illesztése 26 parszimónia szempontjából informatív karaktert tartalmazott. Az analízis eredményeként kapott 653 egyforma hosszúságú fa közül egyet a 50. ábra mutat be (fahossz: 81, konzisztencia index: 0,74419, retenciós index: 0,9052). A vöröshagymamintákból nyert mind a 35 fekete Aspergillus izolátum az A. awamori fajhoz tartozott. Perrone és mtsai (2010) multilókusz szekvencia vizsgálat és AFLP analízis alapján megállapították, hogy az A. awamori, az A. niger-hez hasonló filogenetikai faj. Ez a faj az A. niger-től a molekuláris adatok, pl. számos fehérjét (β-tubulin, kalmodulin, α transzlációs elongációs faktor) kódoló gén szekvenciája alapján (Perrone és mtsai 2010) valamint AFLP és RAPD analízissel is (nem közölt adatok) könnyen megkülönböztethető.

Az A. niger-hez hasonlóan az A. awamori izolátumok jelentős százaléka is képes ochratoxinok és fumonizinek bioszintézisére (Varga és mtsai 2010; Frisvad JC, személyes közlés).

A fumonizinek liofilizált vöröshagymaminták kivonataiból történő meghatározásához szintén többpontos (1 pg – 50 ng FB1 és FB2 injektálva az oszlopra) külső standard kalibrációt alkalmaztunk. Az FB1 és FB2 toxin kalibrációs görbéje a 10 pg – 10 ng tartományban lineáris volt (r²=0,9989 és 0,9971). Az FB1 és FB2 toxinok oldataival végzett visszanyerési vizsgálatok során 0,1 és 1 mg/kg koncentrációban adagoltuk a referencia anyagokat a kontroll vöröshagyma (G minta) liofilizált pormintáihoz. A visszanyerési értékek az FB1 és FB2 toxinra 93,7 és 96,7% illetve 90,4 és 99,4% volt.

Két mintában (A és C) detektáltunk fumonizineket (51. ábra), teljes mennyiségük 0,32 és 0,33 mg/kg volt (22. táblázat). FB2-4, 3-epi-FB4 és izo-FB1 (Mansson és mtsai 2010 szerint FB6 toxin) toxinokat mutattuk ki, amelyeket az A. awamori fumonizin-termelésével is kapcsolatos korábbi közleményünkben már leírtunk (Varga és mtsai 2010). Korábban egy másik fumonizin-termelésre képes gombafajról, a F. proliferatum-ról is kimutatták, hogy a vöröshagymát is képes megfertőzni (Dissanayake és mtsai 2009a,b; Du Toit és mtsai 2003; Galvan és mtsai 2008; Stankovic és mtsai 2007). Vizsgálataink során azonban ezt a gombafajt a vöröshagymákról nem tudtuk izolálni.

A. brasiliensisCBS 101740

50. ábra. A vöröshagymáról származó fekete Aspergillus izolátumok filogenetikai fája és fajszintű besorolásuk a kalmodulin szekvencia adatok alapján. Az ágak fölötti számok a

„bootstrap” értékeket jelzik.

Továbbá, a F. proliferatum legnagyobb mennyiségben termelt fumonizinje az FB1 toxin, amely a fertőzött vöröshagymamintákban nem volt kimutatható. Helyette az FB2 és FB4

toxinokat mutattuk ki a legnagyobb mennyiségben, amelyek az A. niger és az A. awamori fő fumonizinjei (Frisvad és mtsai 2007; Mogensen és mtsai 2010a; Varga és mtsai 2010).

Ezek az adatok jelzik, hogy feltehetően az A. awamori felelős a vöröshagymák fumonizin-szennyezéséért. Korábbi vizsgálatok jelezték, hogy az A. niger/A. awamori izolátumok

kétharmada képes fumonizineket termelni (Noonim és mtsai 2009; Logrieco és mtsai 2009;

Mogensen és mtsai 2010; Varga és mtsai 2010). Érdekes eredmény, hogy az „A” mintában a 3-epi-FB4 mennyisége meghaladta az FB4 mennyiségét, ugyanakkor korábbi munkánk során a mazsolamintákban az FB4 mennyisége minden esetben meghaladta a 3-epi-FB4

mennyiségét (Varga és mtsai 2010). Csak nyomnyi mennyiségben (a jel/zaj viszony 3-4x-ese) sikerült kimutatni az FB3 toxint (A és C minta), az izo-FB1 (FB6) toxint (A minta) és az FB2,3(1) toxint (A és C minta, Varga és mtsai 2011).

51. ábra. Vöröshagymaminták (A és C) RP-HPLC/ESI–ITMS extrahált ion kromatogramja (EIC, m/z 690+706+722).

A hagymában található alliin és egyéb antimikrobiális hatású komponensek miatt viszonylag kevés gombafaj képes rajta növekedni (Filtenborg és mtsai 1996), aminek következményeként elég ritkán lehet mikotoxinokat találni benne. Ochratoxint sem tudtak még kimutatni vöröshagymában, sőt amikor patulin-termelő Penicillium expansum, P.

urticae vagy Byssochlamys nivea törzsekkel fertőzték a hagymát, akkor sem tudtak patulint kimutatni (Frank 1977), mivel a műszerek akkori érzékenysége nagyságrendekkel elmaradt

a mikotoxin mérésre alkalmas mai berendezések érzékenységétől. A malformint amely az A. niger másodlagos anyagcseréjének terméke, a vöröshagyma külső burokleveleiben tudták kimutatni (Curtis és mtsai 1974). Noha az FB1 toxint már azonosították F.

proliferatum által fertőzött fokhagymában (Seefelder és mtsai 2002), ismereteink szerint vöröshagymában fumonizineket még nem mutattak ki. A két vöröshagymamintában viszonylag alacsony koncentrációban (~0,3 mg/kg) mutattunk ki fumonizineket (22.

táblázat), vizsgálataink jelentőségének megítéléséhez több, különféle helyről (több országból) származó vöröshagymamintát célszerű a jövőben megvizsgálni.

22. táblázat. Vöröshagymaminták fumonizin-tartalma.

Minta

A detektált fumonizinek mennyisége (µg/kg)^a

FB2 FB3 FB4 3-epi-FB4 izo-FB1 (FB6) izo-FB2,3(1)

Teljes

fumonizin-tartalom

A 203,75 9,50 48,46 58,58 6,21 16,14 324,64

B - - - - - - -

C 16,73 25,06 288,22 - - - 330,01

D - - - - - - -

E - - - - - - -

F - - - - - - -

G - - - - - - -

a Az FB1 kalibrációs görbéjét és visszanyerési értékét az izo-FB1, míg az FB2 kalibrációs görbéjét és visszanyerési értékét az FB2, FB3, FB4, 3-epi-FB4 and izo-FB2,3(1) toxinok mennyiségi kiértékeléséhez alkalmaztuk; -, nem detektálható.

Korábban, az A. niger és az A. awamori gombafajokkal kapcsolatban igazolták, hogy a fuzáriumokkal szemben alacsony vízaktivitás mellett is képesek fumonizineket termelni (Frisvad és mtsai 2007; Varga és mtsai 2010). A magas cukortartalmú mezőgazdasági termékeken kívül (pl. mazsola, füge) úgy tűnik, hogy a vöröshagyma viszonylag száraz külső buroklevelei elősegítik ezeknek a gombafajoknak a fumonizin-termelését. További vizsgálatok szükségesek annak az igazolására is, hogy vajon a fekete Aspergillus fajok a tárolás során szennyezik a vöröshagymát, vagy még a szántóföldön, mivel több szerzőnek is az a véleménye, hogy az A. niger-nek endofita életmódja van a hagymában (Lorbeer és mtsai 2002; Tuffley és Lorbeer 2002; Palencia és mtsai 2010).