2. Anyagok és módszerek
2.2. Etil-acetát előállítása szakaszos rendszerben
2.2.1. Anyagok
A felhasznált anyagokat (név, eredet, tisztaság) a 2.2.1. táblázat mutatja be.
2.2.1. táblázat: A mérések során felhasznált anyagok
Anyag neve Tisztaság Forrás
Candida antarctica lipáz B enzim - Novozymes, Bagsvaerd, Dánia 1-butil-3-metil-imidazolium
tetrafluoro-borát1; [bmim]BF4
>98% Solvent Innovation GmbH, Köln, Németo.
1-butil-3-metil-imidazolium hexafluoro-foszfát1; [bmim]PF6
>98% Solvent Innovation GmbH, Köln, Németo.
1-butil-3-metil piridinium tetrafluoro-borát1; [bmpy]BF4
>98% Solvent Innovation GmbH, Köln, Németország
1-etil-3-metil-imidazolium toloul-szulfonát1; [emim]ToS
>99% Ionic Liquid Technologies GmbH
& Co KG, Denzlingen, Németo.
N-butil-N-metil-pirrolidium bisz(trifluorometilszulfonil)imid1;
[bmpyr]Tf2N
>99% Ionic Liquid Technologies GmbH
& Co KG, Denzlingen, Németo.
1-butil-3-metil-imidazolium metilén-szulfát1; [bmim]MeSO4
>99% Ionic Liquid Technologies GmbH
& Co KG, Denzlingen, Németo.
Butil-trimetil-ammónium bisz(trifluorometilszulfonil)imid1;
[(bmmm)N]Tf2N
>99% Ionic Liquid Technologies GmbH
& Co KG, Denzlingen, Németo.
Ecetsav 99-100% Spektrum 3D, Debrecen
Etanol >99,7% Spektrum 3D, Debrecen
n-Hexán >96% Scharlau GmbH, Köln
Desztillált víz Λ < 10µS MÜKKI
1 Valamennyi ionos folyadék elnevezése és képlete a „Definíciók és rövidítések” c. fejezetben található
2.2.2. Módszerek
A reakcióelegy összeállítása
A reakcióelegy összeállításánál fontos szempont volt, hogy az oldat ne legyen túl tömény (korrozív), így az ecetsav koncentrációját alacsonyra, 0,786 mol/dm3-re állítottam be. Az etanolt fölöslegben (az egyensúly eltolása céljából), különböző mólarányokban adagoltam. A reakcióelegyhez a szubsztrátokon kívül kis mennyiségben vizet is adtam (0,5-5 térfogat% víztartalomig).
A bemérést analitikai mérlegen végeztem, 0,1 mg pontossággal. Egy méréssorozathoz 5 cm3 reakcióelegyre volt szükség, melyet mérőlombikokba mértem be. A bemérendő ecetsav mennyiségét ennek alapján számítottam ki (2.2.2. táblázat):
2.2.2. táblázat: Az etil-acetát enzimes előállítása során bemért anyagok
Komponens koncentráció n (mmol) m (mg)
Ecetsav 0,786 (mol/dm3) 3,93 236
Etanol n×0,786 (mol/dm3) n × 3,93 n × 181
Víz 0,5-5 vol% 1,39-13,9 25-250
Ezen komponensek bemérése után a mérőlombikot ionos folyadékkal jelre töltöttem, és négy-ötszöri átbuktatással homogenizáltam az elegyet.
Tekintettel arra, hogy a rendelkezésre álló ionos folyadékok igen drágák, csak kis mennyiségű reakcióelegyekkel dolgoztam. Emiatt a reakciót kisméretű, 1,5 cm3 űrtartalmú műanyag csövecskékben (Eppendorf-csövekben) hajtottam végre. Az Eppendorf-csövekbe automata pipettával 800-800 µl reakcióelegyet mértem be. 5 cm3 reakcióelegy esetén így 6 adag (6×0,8 = 4,8 cm3) elkészítésére volt lehetőség, azaz hat különböző időpontban vizsgáltam a konverziót.
Inkubálás rázógépben
Az enzimet mindegyik Eppendorf-csőbe közvetlenül csak az inkubálás előtt mértem be. A kis edényeket ezután (egy tartóban elhelyezve) rázógépbe tettem (NEW BURNSWICK SCIENTIFIC G24), ahol adott hőmérsékleten inkubáltam. A rázatás intenzitását 150 1/perc értékre állítottam be, ami még nem teszi ki túl erős nyíróhatásoknak az enzimet, ugyanakkor már elegendő a rendszer megfelelő homogenizálásához. Ezt a rázatási intenzitást úgy határoztam meg, hogy különböző
rázatási sebességek (0, 50, 100, 150, 200, 250 és 300 1/perc) mellett végeztem enzimes észterezéseket ugyanazon kezdeti reakcióelegyekkel, és összehasonlítottam a kezdeti reakciósebességeket. 0 és 150 1/perc intenzitás között a reakciósebesség monoton nőtt, ugyanakkor a 150 és 200 1/perc rázatási sebesség között nem tapasztaltam szignifikáns különbséget. 250 1/perc fordulatszámon (és e fölött) az enzimkészítmény szemcséi viszont már szemmel láthatóan károsodtak (az enzimtöredékektől a reakcióelegy színe opálos lett).
Az analízis céljából meghatározott időtartamok elteltével (0,5; 1; 2; 3,5; 5 és 24 óra után) 1-1 Eppendorf-csövet kivettem a rázógépből, és meghatároztam a konverzió mértékét.
A minta előkészítése analízisre
Az inkubátorból kivett minta etil-acetát tartalmát gázkromatográffal határoztam meg; az etil-acetát tartalomból pedig meghatároztam a konverzió mértékét. Mivel az ionos folyadékoknak gyakorlatilag nincs gőznyomása, a minta közvetlenül nem elemezhető gázkromatográfiásan, az etil-acetátot először ki kell extrahálni az ionos folyadék fázisból, és az extraktumot lehet elemezni. Irodalmi adatok alapján megfelelő extrahálószerek az apoláris oldószerek, például az éterek, a toluol vagy a hexán. Ezek közül választásom a n-hexánra esett, mivel
1. nem elegyedik az ionos folyadékokkal, ugyanakkor jó oldószere az etil-acetátnak;
2. kevésbé káros az egészségre, és mérsékeltebben robbanásveszélyes, mint az éterek vagy a toluol;
3. a GC retenciója igen kicsi, így elsőnek távozik az oszlopról és a csúcs nem zavarja más komponensek elemzését;
4. tisztasága kifogástalan (>99%), olcsó (kb. 3000 Ft/liter) és nagy mennyiségben rendelkezésre áll.
Az extrakció műveletét a következőképpen hajtottam végre: az Eppendorf-cső tartalmát egy kb. 20 cm3-es űrtartalmú, csavaros kupakkal lezárható centrifugacsőbe töltöttem át és 3 cm3 hexánt adagoltam hozzá pipettából úgy, hogy közben a hexánnal az Eppendorf-csövet is átmostam. Ezután lezártam a centrifugacsövet, és kb. 1 percen keresztül intenzíven ráztam (kézzel), majd a centrifugacsövet szerves fogóval függőleges helyzetben rögzítettem. A fázisok egy-két perc alatt tökéletesen kettéváltak:
minden esetben az ionos folyadék volt az alsó fázis, és az enzimszemcsék vagy az ionos
folyadék fázis belsejében, vagy a fázishatáron helyezkedtek el. A felső (extraktum) fázist pipettával óvatosan felszívtam és egy 10 cm3-es mérőlombikba gyűjtöttem. A műveletet háromszor ismételtem meg, így kb. 3 × 3 = 9 cm3 hexános extraktumot gyűjtöttem a mérőlombikba, melyet a művelet végén hexánnal jelre töltöttem.
Gázkromatográfiás analízis
Egy elemzés alkalmával 0,5 µl hexános extraktumot injektáltam a GC-re Hamilton fecskendővel. Mivel mind a hexán, mind az etil-acetát igen illékony, a megfelelő szétválasztáshoz alacsony értékre, 45 °C-ra állítottam be a kolonnatér kezdeti hőmérsékletét. A következő hőmérsékleti programozást alkalmaztam: 3 perc elteltével a kolonnatér hőmérsékletét fokozatosan növeltem (10 °C/min értékkel), egészen 200 °C-ig, mely értéken 5 percig maradt. A kolonna hőmérséklete csak ezután állt vissza a kezdeti, 45 °C-os hőmérsékletre. Erre a hőmérsékleti programozásra azért volt szükség, hogy a mintában lévő kevésbé illékony komponensek (ecetsav, esetleges szennyező anyagok) is biztosan távozzanak az oszlopról. A GC beállításai a 2.2.2. táblázatban láthatók. A gázkromatográfiás elemzés során a gázok térfogatáramát buborékos mérővel határoztam meg (2.2.3 táblázat). Az egyes komponensek retenciós idői a 2.2.4.
táblázatban láthatók, a 2.2.1. ábrán pedig az egyik jellemző minta kromatogramját mutatom be.
2.2.2. táblázat: A GC beállításai és programozása etil-acetát elemzése során
Kolonna fejnyomás 80 kPa
Injektor hőmérséklet 250 °C
FID detektor hőmérséklet 250 °C
Range (érzékenység) 7
2.2.3. táblázat: A GC-re kerülő gázáramok
Vivőgáz (N2) 11 ml/min
Éghető gáz (H2) 26 ml/min
Égést tápláló gáz (levegő) 263 ml/min
2.2.4. táblázat: Az egyes komponensek retenciós idői
Retenciós idő (min) Komponens
1,11 n-Hexán
1,75 Etil-acetát
2,10 Etanol
10,22 Ecetsav
2.2.1. ábra: Az etil-acetát enzimes előállítása során kapott kromatogramok egyike