1. Irodalmi összefoglaló
1.3. Enzimkatalitikus folyamatok ionos folyadékokban
1.3.3. Az enzimek aktivitása és stabilitása ionos folyadékokban
Már a legelső ionos folyadék közegű enzimkatalitikus reakciók vizsgálata során azt tapasztalták, hogy bizonyos enzimek szelektivitása ionos folyadékokban jelentősen megnőhet (l. 1.3.2. fejezet), ugyanakkor az enzim dezaktiválódása számos esetben lassabban megy végbe ebben a közegben. Erbeldinger és munkatársai a termolizint [bmim]PF6-ban és etil-acetátban inkubálva azt tapasztalták, hogy az ionos folyadékban (ahol az enzim aktivitása már eredetileg is kb. 40%-kal magasabb, mint etil-acetátban)
az aktivitás az inkubációs idő növelésével kismértékben még nőtt is, míg etil-acetátban lassan csökkent (Erbeldinger, 2000).
Presson és Bornscheuer a Bacillus stearotermophilus észteráz aktivitását vizsgálta különböző reakcióközegekben (Presson és Bornscheuer, 2003). Azt tapasztalták – hasonlóan Park és Kazlauskas tapasztalataihoz (Park és Kazlauskas, 2003)– hogy a szabad enzim ionos folyadékban nem vagy alig mutat aktivitást, azonban a hordozóra rögzített enzim magasabb enantioszelektivitást mutatott [bmim]PF6, [bmim]BF4 és [bmim]Tf2N ionos folyadékokban, mint hexánban, MTBE-ben vagy vinil-acetátban. Az enzim aktivitásának felezési ideje (az az időtartam, ami alatt az enzim aktivitása a felére csökken) [bmim]BF4-ben és [bmim]PF6-ban kb. háromszor nagyobb volt, mint MTBE közegben, és közel harmincszor annyi, mint hexánban (Presson és Bornscheuer, 2003).
Lozano kutatócsoportja egy Candida antarctica lipázzal és egy α-Chymotrypsin enzimmel végzett átészterezést vizsgált oldószermentes (n-propanol) rendszerben, valamint ionos folyadékokban (l. 1.3.2. fejezet) (Lozano, 2003). Az enzim stabilitásának vizsgálata során megállapították, hogy a Candida antarctica lipáz aktivitásának felezési ideje [emim]BF4 ionos folyadékban közel háromszor akkora, mint n-butanolban (oldószermentes rendszer) vagy n-hexánban (e két utóbbi érték közel azonos). Az α-Chymotrypsin aktivitásának felezési ideje több ionos folyadékban ([moooN]Tf2N, [bmim]BF4) átlagosan 1 nagyságrenddel volt magasabb, mint propanolban. Egy későbbi tanulmányukban (2005) Lozano és munkatársai az α-chymotripsint vízben, 1-propanolban és [emim]Tf2N-ben 30 °C-on inkubálták, és különböző időpontokban vizsgálták az enzim aktivitását (Lozano, 2005). Ennek során azt tapasztalták, hogy az aktivitás 1-propanolban csökken a leggyorsabban (20 perc alatt kb. 75%-kal), míg vízben közel egyenletes ütemben csökkent az aktivitás (1 óra alatt kb. 30%-kal). Az ionos folyadékban az enzim aktivitása 20 perc alatt közel 30%-ot csökkent, azonban ezután az enzim aktivitása egy közel állandó értéken stabilizálódott.
Hasonló eredményeket tapasztaltak Candida antarctica lipáz B esetében is: míg a hexánban történő inkubálás során az aktivitás 120 óra alatt az eredeti értékének kb.
20%-ára csökkent (és továbbra is csökkenő tendenciát mutatott), addig [emim]Tf2N és [bmmmN]Tf2N ionos folyadékokban csak az inkubáció első 30 órájában csökkent az aktivitás (az eredeti érték 70-80%-ára), ezt követően pedig egy közel állandó értékre állt be.
Az eltérő polaritású szerves oldószerekhez hasonlóan különböző ionos folyadékok hidrofil, illetve hidrofób jellegüknél fogva eltérő hatást fejthetnek ki az enzimekre. Míg szerves oldószerekben elsősorban a polaritás (Gubicza, 1992), ionos folyadékokban elsősorban az anion határozza meg az enzim aktivitását (Sheldon, 2002; Garcia, 2004;
Lau, 2004). Sheldon és munkatársai ugyanazon enzimes reakció többféle ionos folyadékban történő vizsgálta során azt tapasztalták, hogy a koordinációra erősebben hajlamos, nukleofil jellegű anionokat (NO3
-, laktát-, EtSO4
-) tartalmazó ionos folyadékokban az enzimaktivitás lényegesen alacsonyabb, mint más ionos folyadékokban, illetve szerves oldószerben (Sheldon, 2002). A 2002-ben közölt publikációban azt feltételezték, hogy az aktivitáscsökkenés annak tudható be, hogy a nukleofil jellegű anionok az enzim konformációját kedvezőtlenül változtatják meg.
Elméletüket 2004-ben FT-IR vizsgálatokkal igazolták (Lau, 2004). Ez utóbbi publikációban azt is kifejtik, hogy a koordinációra erősen hajlamos laktát anion hidrogénkötéseket alakít ki az enzimfehérje polipeptid-láncával, ezáltal megváltoztatja a koordinációját („protein unfolding”).
Az ionos folyadékokban az enzimek hőtűrő képessége is jelentősen megnőhet (Sheldon, 2002; Ulbert, 2005), ami abból a szempontból előnyös, hogy magasabb hőmérsékleten a reakciók is gyorsabban játszódnak le, ezen kívül a reakcióelegy viszkozitása is csökken, ami tökéletesebbé teszi az átkeverést. Ulbert-tel végzett kísérleteink során a Candida rugosa lipáz aktivitását, illetve az aktivitás felezési idejét hasonlítottuk össze szerves oldószerekben illetve ionos folyadékokban, különböző hőmérsékleteken (1.3.9. ábra; Ulbert, 2005).
30 oC
1.3.9. ábra: A Candida rugosa enzim aktivitáscsökkenése különböző közegekben (Ulbert, 2005, ▲dibutil-éter, ■benzol, ♦n-hexán, * [bmim]PF6 + [omim]PF6)
Az 1.3.9. ábrán látható, hogy alacsonyabb hőmérsékleten (30 °C), [bmim]PF6-ban és [omim]PF6-ban kb. kétszer akkora a felezési idő, mint hexánban, 50 °C-on a felezési idő ionos folyadékban már kb. egy nagyságrenddel nagyobb volt, mint a szerves oldószerekben.
1.3.4. A természetes aromák jelentősége és az etil-acetát enzimes előállítása
A kereskedelemben növekszik az illatosított illetve ízesített termékek iránti kereslet (illatosítók, gyümölcsitalok, joghurtok, fagylaltok, szeszes italok, rágógumi stb.).
Amennyiben mindezeket 100%-ban valódi gyümölcsökből állítanák elő, az igen nagy termőterületet és hatalmas költségeket (termesztés, betakarítás, feldolgozás) igényelne.
Emiatt terjedtek el a szintetikusan előállított aromák.
A legtöbb íz és illat néhány száz egyedi komponensből tevődik össze, de ez a komplexitás csökkenthető, ha csak néhány kulcskomponenst, főképp szerves savakat, alkoholokat és különösen az észtereket vesszük figyelembe (Berger, 1995). Néhány gyümölcs illatának legfontosabb észter komponensei az 1.3.3. táblázatban láthatók.
Ezen komponensek szintézise enzimes észterezéssel is lehetséges (Leblanc, 1998;
Krishna, 2001). Fontos előny, hogy az Európai Unió előírásai szerint a természetes alapanyagokból (pl. növényekből előállított alkoholok, szeszipari melléktermékek, erjesztett ecetsav stb.) biotechnológiai úton előállított aromák „természetes aroma”
címen forgalmazhatók.
1.3.3. táblázat: Kis szénatomszámú észterek előfordulása különböző gyümölcsökben
Komponensek Eper Banán Ananász
etil-acetát + + +
propil-acetát + +
butil-acetát + +
izoamil-acetát + + +
etil-butanoát +
butil-butanoát + +
Kísérleteim során az egyik vizsgált reakció egy fontos aromaészter, az etil-acetát ionos folyadék reakcióközegben történő enzimes előállítása volt. Az etil-acetát
nem-konvencionális közegben történő előállítását már 1986-ban vizsgálta Armstrong és Yamazaki (Armstrong és Yamazaki, 1986). Ők n-hexán reakcióközegben tapasztalták a legjobb hozamot. Gubicza és munkatársai szintén hexánban, illetve heptánban és n-pentánban, (Gubicza és Szakács-Schmidt, 1995/a; Gubicza, 2000; Bélafi-Bakó, 2003) később pedig –az oberhauseni (Németország) UMSICHT kutatóintézettel együttműködve– oldószermentes rendszerben is vizsgálták az etil-acetát enzimes előállítást (Ehrenstein, 2003; Bélafi-Bakó, 2003). Ennek során n-pentánban 93,2%
észter hozamot tapasztaltak, azonban ezzel az oldószerrel legfeljebb 36°C-on tudtak dolgozni a pentán alacsony forráspontja miatt. Heptánban és oldószermentes rendszerben meghatározták a reakció kinetikáját (Bélafi-Bakó, 2003), melyben egy módosított Michaelis-Menten kinetikát állapítottak meg:
1 2 max
0
K S S / K
S v v
M
+ +
=
(1)A képletben v0 a kezdeti reakciósebesség, vmax a legnagyobb reakciósebesség, S a szubsztrátum koncentrációja, KM a Michaelis-Menten állandó, KI pedig az inhibíciós állandó. A kísérletek során mindezen kinetikai konstansok meghatározásra kerültek (Bélafi-Bakó, 2003).
Az inhibíciót elsősorban az ecetsav okozza, így a reakciónak az alkoholfelesleg kedvez. Ugyanakkor az etanol is okoz kisebb mértékű gátlást, ami a nagyobb alkoholfelesleg, illetve az etanol fölöslegében végrehajtott oldószermentes észterezés során csökkenő tendenciát mutató kezdeti reakciósebességeken tűnik szembe (Bélafi-Bakó, 2003). Ennek megfelelően az oldószer jelenléte az enzim stabilitása szempontjából fontos (a rendszer nem lesz túl tömény a szubsztrátumra nézve), ugyanakkor a hagyományos szerves oldószerek illékonyak és ennek következtében számos hátránnyal bírnak. Kézenfekvő tehát az etil-acetát ionos folyadékban történő enzimes előállításának tanulmányozása, amit –az irodalom áttanulmányozása alapján–
korábban még nem vizsgáltak.
1.3.5. A 2-klór propionsav enzimes észterezése n-butanollal
Kísérleteim során az etil-acetát mellett a butil-2-klór-propionát enzimes előállítását is vizsgáltam ionos folyadékokban.
A királis alkoholok és karbonsavak dinamikus rezolválására már régóta alkalmazzák az enzimes észterezést (Marshek, 1973). Az enzimes észterezés szempontjából –mint az 1.3.1. fejezetben kifejtettem– fontos áttörést jelentett Zaks és Klibanov felfedezése, hogy az enzimek szerves oldószerben is aktivitást mutatnak (Zaks és Klibanov, 1984).
Klibanov kutatócsoportja 1985-ben a 2-szubsztituált királis karbonsavak (többek közt a 2-klór-propionsav) észterezését vizsgálta (Kirchner, 1985). A kísérletek során az (R,S) 2-klór-propionsavat n-butanollal észterezték Candida cylindracea lipáz jelenlétében. A kísérleteket n-hexán oldószerben elvégezve 42%-os konverziót és ee (R) = 95%-os enantioszelektivitást tapasztaltak. Ugyanezt az észterezési reakciót –ugyancsak Candida cylindracea lipázzal– Gubicza a n-hexánon kívül más, különböző polaritású szerves oldószerekben (THF, kloroform, benzol, toluol, metil-ciklohexán, n-oktán) is vizsgálta (Gubicza, 1992/a). Ennek során azt tapasztalta, hogy az oldószer polaritásának csökkenésével nő a kezdeti reakciósebesség, egyúttal viszont csökken az enantioszelektivitás. A jelenséget Gubicza azzal magyarázta, hogy a polárosabb oldószerek (THF, kloroform) az enzim számára nélkülözhetetlen vizet „elvonják”, melynek következtében az enzim konformációja lényegesen merevebb lesz, aktivitása lecsökken. Másrészről viszont, ez a merev szerkezet sokkal kevésbé teszi lehetővé, hogy a sztérikusan gátolt „kedvezőtlen” enantiomer az enzim aktív centrumába kapcsolódjon, így az enantioszelektivitás nő (Gubicza, 1992/a).
A szerves oldószerek után a reakciót ionos folyadékokban többen is kutattuk, melynek során a reakció enantioszelektivitását Ulbert vizsgálta. [bmim]PF6-ban és [onim]PF6-ban lényegesen magasabb enantioszelektivitást tapasztaltunk, mint szerves oldószerekben (THF, toluol és hexán). Különböző 2-szubsztituált propionsavak észterezése esetén [bmim]PF6-ban hasonló vagy kissé alacsonyabb hozamot tapasztaltunk, mint n-hexán reakcióközegben, azonban az enantioszelektivitás mindegyik szubsztrátum esetén lényegesen magasabb volt az ionos folyadékban (Ulbert, 2004).
2. Anyagok és módszerek
2.1. Enantioszelektív hidrogénezés ionos folyadékokban
2.1.1. Anyagok
A felhasznált anyagokat (név, eredet, tisztaság) a 2.1.1. táblázat mutatja be.
2.1.1. táblázat: Az enantioszelektív hidrogénezés során felhasznált anyagok
Anyag neve Tisztaság Forrás
1-butil-3-metil-imidazolium tetrafluoro-borát1 [bmim]BF4
>98 % Solvent Innovation GmbH, Köln, Németo.
1-butil-3-metil-imidazolium hexafluoro-foszfát1 [bmim]PF6
>98 % Solvent Innovation GmbH, Köln, Németo.
1 butil-3-metil-piridinium tetrafluoro-borát1 [bmpy]BF4
>98 % Solvent Innovation GmbH, Köln, Németo.
Izopropanol >99 % Spektrum 3D, Debrecen
Diklór-metán >99,9 % Spektrum 3D, Debrecen Diazo-metán (Diazald®) 99 % Sigma-Aldrich Co.
(Z)-α-acetamido-fahéjsav (AFSAV) >99 % Sigma-Aldrich Co.
(Z)-α-acetamido-fahéjsav-metilészter (AFME)
>99 % Saját preparátum2
[Rh(NBD)((S,S)-DiMe-BDPP)]PF6 (K1) >99 % Saját preparátum3 [Rh(COD)((R,R)-DiPamp))]BF4 (K2) >99 % Saját preparátum4 Kísérleteim során kétféle szubsztrátum (AFSAV, ill. AFME) hidrogénezését vizsgáltam kétféle Rh-komplex katalizátorral (K1 és K2). A szubsztrátumok és a katalizátorok szerkezetét a 2.1.1. ábra mutatja. Mindkét komplex egy Rh(I) központi atomot tartalmaz, melyhez koordinative kapcsolódik egy ciklikus dién (ciklooktadién = COD vagy norbornadién = NBD), illetve a királis difoszfin ligandum. A komplex
1 Valamennyi ionos folyadék elnevezése és képlete a „Definíciók és rövidítések” c. fejezetben található
2 Standard eljárás szerint készítve (King, 1979)
3 Részletesen: Herseczki, 2004
4 Vineyard, 1977 alapján
egyszeresen pozitív töltését tetrafluoro-borát (BF4¯) illetőleg hexafluoro-foszfát (PF6¯)
2.1.1. ábra: A kísérletek során használt szubsztrátumok és hidrogénező katalizátorok
2.1.2. Módszerek
Bemérés és a reakció végrehajtása
A Rh-komplex oxigénre való érzékenysége miatt minden műveletet inert (argon) atmoszféra alatt végeztem. Egy Schlenk-csőbe bemértem 6,1×10-6 mol Rh komplex katalizátort (K1 vagy K2), majd ezt feloldottam 3 cm3 ionos folyadékban. Egy másik Schlenk-csőbe 1,2 mmol szubsztrátumot (AFSAV vagy AFME) mértem be. 9 cm3 izopropanol hozzáadása után a kristályok feloldódásáig kevertettem a rendszert. A két homogén oldatot fecskendővel egy hidrogén gázzal előzőleg átöblített (szekurált), 50 cm3 űrtartalmú autoklávba juttattam. Ezután az autoklávot hidrogénnel adott nyomásra töltöttem, termosztáló vízfürdőbe helyeztem, és a reakcióelegyet 950 1/perc intenzitással kevertettem. A reakció lejátszódása alatt az autoklávban lévő nyomást figyelemmel kísértem.
Mintavétel és előkészítés
A reakcióidő lejárta után a reakcióelegyet argon atmoszféra alatt egy másik Schlenk-csőbe szívattam át (inert kivétel). Az emulzió lassan (kb. fél óra alatt) vált ketté, a felső izopropanolos fázis tartalmazta a terméket, míg az alsó, ionos folyadékos fázis a katalizátort. A felső fázisból osztott pipettával kb. 0,2 cm3 mintát vettem egy kisméretű csiszolatos kémcsőbe, ehhez diazo-metánt fejlesztő vegyületet (Diazald) adtam, majd termosztáló fürdőben (kb. 40 °C) vákuum segítségével (vízsugárszivattyú, 2700 Pa, kb. 20 Hgmm) eltávolítottam a maradék metánt és az oldószert. A diazo-metán a szabad karboxilcsoportokat metilezte, erre a gyorsabb gázkromatográfiás elemzés (kisebb retenciós idők) miatt volt szükség. A metilezett termékeket ezután diklór-metánban feloldottam és gázkromatográfiásan elemeztem.
Analízis
Az elemzést HP 4890 típusú gázkromatográffal (GC) végeztem. A kolonna Chirasil L-Val királis oszlop (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm) volt. A vivőgáz nitrogén, a detektor lángionizációs (FID) típusú volt. A metilezett termékek retenciós idői: 28 perc (R) és 30 perc (S). Egy jellemző kromatogramot mutat be a 2.1.1. ábra.
Az enantioszelektivitás vizsgálata során az enantiomer fölösleget (enantiomeric excess; ee) határoztam meg. Az ee számítását részletesen a „Definíciók és rövidítések”
c. fejezetben ismertetem. A mérések statisztikai értékelését és szórását „A mérések pontossága” c. fejezetben részleteztem.
2.1.2. ábra: A hidrogénezett termékből vett minta GC kromatogramja
2.2. Etil-acetát előállítása szakaszos rendszerben
2.2.1. Anyagok
A felhasznált anyagokat (név, eredet, tisztaság) a 2.2.1. táblázat mutatja be.
2.2.1. táblázat: A mérések során felhasznált anyagok
Anyag neve Tisztaság Forrás
Candida antarctica lipáz B enzim - Novozymes, Bagsvaerd, Dánia 1-butil-3-metil-imidazolium
tetrafluoro-borát1; [bmim]BF4
>98% Solvent Innovation GmbH, Köln, Németo.
1-butil-3-metil-imidazolium hexafluoro-foszfát1; [bmim]PF6
>98% Solvent Innovation GmbH, Köln, Németo.
1-butil-3-metil piridinium tetrafluoro-borát1; [bmpy]BF4
>98% Solvent Innovation GmbH, Köln, Németország
1-etil-3-metil-imidazolium toloul-szulfonát1; [emim]ToS
>99% Ionic Liquid Technologies GmbH
& Co KG, Denzlingen, Németo.
N-butil-N-metil-pirrolidium bisz(trifluorometilszulfonil)imid1;
[bmpyr]Tf2N
>99% Ionic Liquid Technologies GmbH
& Co KG, Denzlingen, Németo.
1-butil-3-metil-imidazolium metilén-szulfát1; [bmim]MeSO4
>99% Ionic Liquid Technologies GmbH
& Co KG, Denzlingen, Németo.
Butil-trimetil-ammónium bisz(trifluorometilszulfonil)imid1;
[(bmmm)N]Tf2N
>99% Ionic Liquid Technologies GmbH
& Co KG, Denzlingen, Németo.
Ecetsav 99-100% Spektrum 3D, Debrecen
Etanol >99,7% Spektrum 3D, Debrecen
n-Hexán >96% Scharlau GmbH, Köln
Desztillált víz Λ < 10µS MÜKKI
1 Valamennyi ionos folyadék elnevezése és képlete a „Definíciók és rövidítések” c. fejezetben található
2.2.2. Módszerek
A reakcióelegy összeállítása
A reakcióelegy összeállításánál fontos szempont volt, hogy az oldat ne legyen túl tömény (korrozív), így az ecetsav koncentrációját alacsonyra, 0,786 mol/dm3-re állítottam be. Az etanolt fölöslegben (az egyensúly eltolása céljából), különböző mólarányokban adagoltam. A reakcióelegyhez a szubsztrátokon kívül kis mennyiségben vizet is adtam (0,5-5 térfogat% víztartalomig).
A bemérést analitikai mérlegen végeztem, 0,1 mg pontossággal. Egy méréssorozathoz 5 cm3 reakcióelegyre volt szükség, melyet mérőlombikokba mértem be. A bemérendő ecetsav mennyiségét ennek alapján számítottam ki (2.2.2. táblázat):
2.2.2. táblázat: Az etil-acetát enzimes előállítása során bemért anyagok
Komponens koncentráció n (mmol) m (mg)
Ecetsav 0,786 (mol/dm3) 3,93 236
Etanol n×0,786 (mol/dm3) n × 3,93 n × 181
Víz 0,5-5 vol% 1,39-13,9 25-250
Ezen komponensek bemérése után a mérőlombikot ionos folyadékkal jelre töltöttem, és négy-ötszöri átbuktatással homogenizáltam az elegyet.
Tekintettel arra, hogy a rendelkezésre álló ionos folyadékok igen drágák, csak kis mennyiségű reakcióelegyekkel dolgoztam. Emiatt a reakciót kisméretű, 1,5 cm3 űrtartalmú műanyag csövecskékben (Eppendorf-csövekben) hajtottam végre. Az Eppendorf-csövekbe automata pipettával 800-800 µl reakcióelegyet mértem be. 5 cm3 reakcióelegy esetén így 6 adag (6×0,8 = 4,8 cm3) elkészítésére volt lehetőség, azaz hat különböző időpontban vizsgáltam a konverziót.
Inkubálás rázógépben
Az enzimet mindegyik Eppendorf-csőbe közvetlenül csak az inkubálás előtt mértem be. A kis edényeket ezután (egy tartóban elhelyezve) rázógépbe tettem (NEW BURNSWICK SCIENTIFIC G24), ahol adott hőmérsékleten inkubáltam. A rázatás intenzitását 150 1/perc értékre állítottam be, ami még nem teszi ki túl erős nyíróhatásoknak az enzimet, ugyanakkor már elegendő a rendszer megfelelő homogenizálásához. Ezt a rázatási intenzitást úgy határoztam meg, hogy különböző
rázatási sebességek (0, 50, 100, 150, 200, 250 és 300 1/perc) mellett végeztem enzimes észterezéseket ugyanazon kezdeti reakcióelegyekkel, és összehasonlítottam a kezdeti reakciósebességeket. 0 és 150 1/perc intenzitás között a reakciósebesség monoton nőtt, ugyanakkor a 150 és 200 1/perc rázatási sebesség között nem tapasztaltam szignifikáns különbséget. 250 1/perc fordulatszámon (és e fölött) az enzimkészítmény szemcséi viszont már szemmel láthatóan károsodtak (az enzimtöredékektől a reakcióelegy színe opálos lett).
Az analízis céljából meghatározott időtartamok elteltével (0,5; 1; 2; 3,5; 5 és 24 óra után) 1-1 Eppendorf-csövet kivettem a rázógépből, és meghatároztam a konverzió mértékét.
A minta előkészítése analízisre
Az inkubátorból kivett minta etil-acetát tartalmát gázkromatográffal határoztam meg; az etil-acetát tartalomból pedig meghatároztam a konverzió mértékét. Mivel az ionos folyadékoknak gyakorlatilag nincs gőznyomása, a minta közvetlenül nem elemezhető gázkromatográfiásan, az etil-acetátot először ki kell extrahálni az ionos folyadék fázisból, és az extraktumot lehet elemezni. Irodalmi adatok alapján megfelelő extrahálószerek az apoláris oldószerek, például az éterek, a toluol vagy a hexán. Ezek közül választásom a n-hexánra esett, mivel
1. nem elegyedik az ionos folyadékokkal, ugyanakkor jó oldószere az etil-acetátnak;
2. kevésbé káros az egészségre, és mérsékeltebben robbanásveszélyes, mint az éterek vagy a toluol;
3. a GC retenciója igen kicsi, így elsőnek távozik az oszlopról és a csúcs nem zavarja más komponensek elemzését;
4. tisztasága kifogástalan (>99%), olcsó (kb. 3000 Ft/liter) és nagy mennyiségben rendelkezésre áll.
Az extrakció műveletét a következőképpen hajtottam végre: az Eppendorf-cső tartalmát egy kb. 20 cm3-es űrtartalmú, csavaros kupakkal lezárható centrifugacsőbe töltöttem át és 3 cm3 hexánt adagoltam hozzá pipettából úgy, hogy közben a hexánnal az Eppendorf-csövet is átmostam. Ezután lezártam a centrifugacsövet, és kb. 1 percen keresztül intenzíven ráztam (kézzel), majd a centrifugacsövet szerves fogóval függőleges helyzetben rögzítettem. A fázisok egy-két perc alatt tökéletesen kettéváltak:
minden esetben az ionos folyadék volt az alsó fázis, és az enzimszemcsék vagy az ionos
folyadék fázis belsejében, vagy a fázishatáron helyezkedtek el. A felső (extraktum) fázist pipettával óvatosan felszívtam és egy 10 cm3-es mérőlombikba gyűjtöttem. A műveletet háromszor ismételtem meg, így kb. 3 × 3 = 9 cm3 hexános extraktumot gyűjtöttem a mérőlombikba, melyet a művelet végén hexánnal jelre töltöttem.
Gázkromatográfiás analízis
Egy elemzés alkalmával 0,5 µl hexános extraktumot injektáltam a GC-re Hamilton fecskendővel. Mivel mind a hexán, mind az etil-acetát igen illékony, a megfelelő szétválasztáshoz alacsony értékre, 45 °C-ra állítottam be a kolonnatér kezdeti hőmérsékletét. A következő hőmérsékleti programozást alkalmaztam: 3 perc elteltével a kolonnatér hőmérsékletét fokozatosan növeltem (10 °C/min értékkel), egészen 200 °C-ig, mely értéken 5 percig maradt. A kolonna hőmérséklete csak ezután állt vissza a kezdeti, 45 °C-os hőmérsékletre. Erre a hőmérsékleti programozásra azért volt szükség, hogy a mintában lévő kevésbé illékony komponensek (ecetsav, esetleges szennyező anyagok) is biztosan távozzanak az oszlopról. A GC beállításai a 2.2.2. táblázatban láthatók. A gázkromatográfiás elemzés során a gázok térfogatáramát buborékos mérővel határoztam meg (2.2.3 táblázat). Az egyes komponensek retenciós idői a 2.2.4.
táblázatban láthatók, a 2.2.1. ábrán pedig az egyik jellemző minta kromatogramját mutatom be.
2.2.2. táblázat: A GC beállításai és programozása etil-acetát elemzése során
Kolonna fejnyomás 80 kPa
Injektor hőmérséklet 250 °C
FID detektor hőmérséklet 250 °C
Range (érzékenység) 7
2.2.3. táblázat: A GC-re kerülő gázáramok
Vivőgáz (N2) 11 ml/min
Éghető gáz (H2) 26 ml/min
Égést tápláló gáz (levegő) 263 ml/min
2.2.4. táblázat: Az egyes komponensek retenciós idői
Retenciós idő (min) Komponens
1,11 n-Hexán
1,75 Etil-acetát
2,10 Etanol
10,22 Ecetsav
2.2.1. ábra: Az etil-acetát enzimes előállítása során kapott kromatogramok egyike
2.3. Etil-acetát előállítása folyamatos rendszerben
2.3.1. Anyagok
A felhasznált anyagok megegyeztek az előző fejezetben megadottakkal. A víztartalom meghatározását Karl Fischer (KF) titrálással végeztem, az ehhez szükséges reagenst 99%-os tisztaságban a Spektrum 3D Kft.-től (Debrecen) szereztem be. Az ecetsavtartalom meghatározásához 0,1 M-os alkoholos KOH oldatot használtam (minden mérés előtt faktorozva), amit Spektrum 3D KOH-ból (> 99%) és Spektrum 3D etanolból (> 99,7%) készítettem.
2.3.2. Módszerek
Integrált bioreaktor-pervaporációs berendezés
A berendezés sémája a 2.3.1. ábrán, fényképe a 2.3.2. ábrán látható.
2.3.1. ábra: Enzim-membrán bioreaktor az etil-acetát enzimes észterezésének vizsgálatára. Jelmagyarázat: 1-reakcióedény mágneskeverővel, 2-intenzív hűtő, 3-perisztaltikus pumpa, 4-hidrofób membrán, 5-hidrofil membrán, 6,7-hűtött csapdák, 8-kifagyasztó, 9,10-szilikonolajos csapdák, 11-zeolitos adszorber, 12-vákuumszivattyú, 13-manométer, 14-szubsztrátum adagoló büretták, 15-termosztát.
2.3.2. ábra: A pervaporációs berendezés fényképe
A modulokat és a bioreaktort 4 mm belső átmérőjű és 1 mm falvastagságú tygon csővezetékkel, a termosztált egységeket a termosztáttal 4 mm belső átmérőjű és 1 mm falvastagságú szilikoncsővel kötöttem össze. A vákuumozott egységeket 5 mm belső átmérőjű és 5 mm falvastagságú vákuum-gumicsővel és üvegeszközökkel (könyökcső, csap) csatlakoztattam egymáshoz.
A reakcióedény (1) egy kb. 140 cm3 űrtartalmú, ötnyakú, mágneses kevertetésű, termosztálható edény volt, melybe 100,0 cm3 reakcióelegyet töltöttem. Az egyik csiszolatba a keringetés során kimenő, egy másikba a bemenő folyadékáram csatlakozását illesztettem. Két további csiszolatba illesztettem a rátápláló pipetták (14) csatlakozásait. Az ötödik csiszolatba egy csapvízzel hűtött intenzív hűtőt (2) helyeztem, melynek falán a reakció hőmérsékletén elpárolgó komponensek kondenzálódtak, és így visszakerültek a rendszerbe. Így a rendszerben nem alakulhatott ki veszélyes túlnyomás, ugyanakkor a párolgási veszteség is minimális volt.
A reakcióelegyet tygon csővezetéken át, egy perisztaltikus pumpával (3) emeltem át a membrán modulokra. A keringetési sebesség 50 cm3/perc volt. A keringetett elegy először egy 12 cm2 felületű Sulzer gyártmányú „Pervap 2255-50” típusú hidrofób (4), majd egy 200 cm2 felületű szintén Sulzer gyártmányú és „Pervap 2201” típusú hidrofil