Enzimes reakciók ionos folyadékokban

Az 1980-as évek közepén Klibanov és Zaks korszakalkotó kísérletei alapján világossá vált, hogy az enzimek szerves oldószer reakcióközegekben is alkalmazhatók (Zaks és Klibanov, 1984), mellyel számos előnyre lehet szert tenni; pl. szerves oldószerben jobban oldódnak bizonyos szubsztrátumok, visszaszorulnak bizonyos mellékreakciók stb.. Ez alapján az enzimeket ma már számos ipari jelentőséggel bíró reakciókban is sikeresen alkalmazzák (1.3.1. táblázat).

1.3.1. táblázat: Az enzimek főbb alkalmazási területei az iparban 2005-ben (Buchholz,

Akril-amid nitriláz Nitto, DSM

6-amino-penicillinsav penicillin amidáz több

Kakaóvaj lipáz Fuji Oil,

Unilever

Izo-maltóz szukróz mutáz Südzucker

>10⁴ t/év

Laktózmentes tej és tejsavó β-galaktozidáz több 7-amino-cefalo-szporánsav amino oxidáz több

7-amino-dezacetoxi-cefalo-szporánsav

glutaril amidáz DSM

(S)-aszparaginsav aszpartáz Tanabe

Aszpartám termolizin Toso, DSM

(S)-metoxi-izopropil-amin lipáz BASF

(R)-pantoténsav aldolaktonáz Fuji che. Ind.

hidantionáz több

(R)-fenil-glicin

karbamoiláz több

>1000 t/év

(S)-aminosavak aminoaciláz Degussa,

Tanabe

Amoxicillin penicillin amidáz DSM

Cefalexin penicillin amidáz DSM

(S)-DOPA β-tirozináz Ajinomoto

karboxipeptidáz A Aventis

Királis alkoholok és aminok lipáz BASF

1000>10

t/év (R)-Mandulasav nitriláz BASF

A szigorodó környezet- és munkavédelmi követelmények következtében kialakuló

„zöld kémia” hatására az illékony szerves oldószerek (VOC-k) visszaszorítása egyre fontosabb feladattá vált. Emiatt a kutatók oldószermentes („solvent-free” vagy

„solventless”) rendszerekben is vizsgálni kezdték az enzimes reakciókat, elsősorban glicerin és más alkoholok nagyméretű acilcsoporttal (pl. olajsavval történő észterezés, foszfatidok előállítása stb.) történő észterezése során (Ming, 1998; Virto, 1999; Bélafi-Bakó, 2003; Dörmő, 2004). Az „oldószermentes” rendszerek alkalmazása során nem alkalmaznak külön hozzáadott szolvenst, hanem valamelyik folyékony halmazállapotú szubsztrátum tölti be az „oldószer” szerepét. Ennek értelmében –„the best solvent is no solvent”– az oldószermentes szintézis látszólag a legjobb megoldást jelentheti a szennyezés megelőzésére, azonban alkalmazása számos területen –így a biotechnológiában is– nehézségekbe ütközik. Az oldószermentes rendszerek túlságosan

„tömények” az enzimek számára, így az esetleges szubsztrát- és termékinhibíciós jelenségek itt fokozottan jelentkeznek, ami az enzimaktivitás csökkenésében nyilvánul meg, így a reakciósebesség ezekben a rendszerekben alacsony (Bélafi-Bakó, 2003). Ez a tény arra ösztönözte a kutatókat, hogy az enzimeket más, környezetkímélőbb reakcióközegekben, például szuperkritikus fluidumokban, ionos folyadékokban, illetve ezek kombinációjában is vizsgálják (Russell, 1994; Garcia, 2004).

Már az 1980-as évek derekán megjelent egy publikáció, mely beszámol arról, hogy egy E.coli-ból származó alkálikus foszfatáz aktivitást mutatott az [C₂H₅NH₃]NO₃ ionos folyadék és víz elegyében (Magunson, 1984). Az enzimaktivitás 1,1 M (10% v/v) IL koncentrációnál érte el az optimumát, nagyobb koncentrációnál az aktivitás fokozatosan csökkent, de 1,1 M koncentrációra visszahígítva a rendszert, visszaállt az eredeti értékére. 80% IL tartalomnál azonban az aktivitás irreverzibilisen megszűnt, ami hasonló a denaturáló sók és szerves oldószerek esetén várható hatáshoz.

Az első ionos folyadékban végzett biokatalitikus transzformációt 2000-ben Erbeldinger és munkatársai hajtották végre (Erbeldinger, 2000). Ők Z-aszpartámot állítottak elő, amit egy igen stabil szerkezetű enzim, a termolizin katalizált.

Reakcióközegként [bmim]PF₆-ot alkalmaztak 5 vol % víztartalom mellett (1.3.1. ábra).

A kísérletek során kapott hozam a szerves oldószerben tapasztaltakhoz hasonló, kb.

95% volt. Annak bizonyítására, hogy az ionos folyadékok ténylegesen alkalmazható alternatív oldószerek, az ionos folyadékot több, egymást követő reakcióciklusban is újrahasznosították. Ezt úgy végezték, hogy a reakcióelegyből vízzel extrahálták az el nem reagált anyagokat, majd az ionos folyadékban visszamaradó vizet a vizes fázis

dekantálása után vákuumbepárlással eltávolították, ami a termék kicsapódásához vezetett. A termék kristályainak leszűrése után az ionos folyadék már csak nyomokban tartalmazott szubsztrát-maradványokat valamint terméket. Az így visszanyert ionos folyadékot újabb reakcióciklusban felhasználták, melynek során kiderült, hogy az ionos folyadék újbóli felhasználása nincs hatással a konverzióra.

O NH reakcióközegben: a Z-aszpartám enzimes előállítása (Erbeldinger, 2000)

Nem sokkal később bebizonyosodott, hogy számos más enzim is mutat katalitikus aktivitást ionos folyadékokban, illetve víz-ionos folyadék kétfázisú rendszerekben.

Különösen a lipázok mutatnak jó aktivitást, enantio- ill. regioszelektivitásuk, stabilitásuk számos esetben ionos folyadék közegekben jobb, mint szerves oldószerekben (Rantwijk, 2003; Ulbert, 2004). Érdekes, hogy míg a mikrobiális eredetű lipázok (pl. Candida antarctica, Pseudomonas cepacita) aktívnak bizonyultak számos ionos folyadékban, ugyanakkor a sertés hasnyálmirigyéből nyert enzim inaktív maradt (Schöfer, 2001)

2000-ben Sheldon és munkatársai az oktánsav lipázos ammonolízise során azt tapasztalták, hogy a reakció lényegesen (kb. négyszer) gyorsabban játszódik le [bmim]BF4 ionos folyadékban, mint szerves oldószerben (1.3.2. ábra). A Candida antarctica lipázzal katalizált reakciót korábban ammónium-karbamáttal, metil-izobutil keton reakcióközegben végezték extrém hosszú, 17 napos reakcióidő mellett (Litjens, 1999). Ionos folyadékban, ammóniával végezve a reakciót az ammonolízis már 4 nap alatt 90-100%-os konverzióval lejátszódott (Lau, 2000).

OH

1.3.2. ábra: Oktánsav ammonolízise Candida antarctica lipáz jelenlétében (Lau, 2000)

Ugyanebben a publikációban Sheldon kutatócsoportja egy ionos folyadékban végzett enzimes epoxidációról is beszámol. A szerves kémiai szintézisek elterjedten alkalmazott oxidálószerei a perkarbonsavak. Az egyre szigorodó biztonságtechnikai követelmények miatt ezen anyagok alkalmazása mára erősen visszaszorult. A robbanásveszélyes anyag veszélyessége azonban jelentősen csökkenthető azáltal, hogy a reakcióelegybe nem közvetlenül adagolják, hanem in situ állítják elő. Sheldon és munkatársai a ciklohexén peroktánsavval végzett epoxidációja során a peroktánsavat hidrogén-peroxidból állították elő enzimmel (CaLB) in situ (1.3.3. ábra). A reakciót [bmim]BF₄-ben végezték, 83%-os ciklohexén-oxid hozamot tapasztaltak, ami csak kissé maradt el az acetonitrilben mért hozamtól (Lau, 2000).

O

1.3.3. ábra: Ciklohexén epoxidációja in situ előállított perkarbonsavval (Lau, 2000)

Számos publikációban számolnak be ionos folyadékokban végzett enzimes átészterezési (alkoholitikus) reakciókról. Lozano és munkatársai többféle reakciót is vizsgáltak ionos folyadékokban: vinil-butirátot észtereztek át butanollal (Candida antarctica lipázzal), valamint N-acetil-(L)-tirozin-etil-észtert észtereztek át propanollal α-Chymotrypsin enzim jelenlétében (1.3.4. ábra) (Lozano, 2003). A vinil-butirát átészterezését oldószermentes rendszerben (1-butanol), szerves oldószerben (n-hexán) valamint négyféle ionos folyadékban ([emim]BF4, [emim]Tf2N, [emim]PF6 és [bmim]Tf2N) is elvégezték. A reakciósebességeket összehasonlítva azt tapasztalták, hogy az enzimaktivitás az ionos folyadékokban kb. 50-100%-kal magasabb volt, mint oldószermentes rendszerben, és 200-300%-kal volt magasabb a hexánban mért értéknél.

Az N-acetil-(L)-tirozin-etilészter átészterezését oldószermentes (n-propanol) rendszerben, és ionos folyadékokban vizsgálták A legjobb reakciósebességet n-propanolban tapasztalták, ennél kb. 40%-kal alacsonyabb értéket találtak [bmim]Tf₂ N-ben; [bmim]BF₄-ben a reakciósebesség a propanolban mértnek mintegy 1/5-e volt. Az enzim stabilitása azonban mindegyik vizsgált ionos folyadékban lényegesen magasabb volt, mint n-propanolban (részletesen l. 1.3.3. fejezet) (Lozano, 2003).

O C₄H₉

1.3.4. ábra: Átészterezési reakciók ionos folyadékokban (Lozano, 2003)

Az enzimes reakciók egyik legfőbb előnye az enzimek királis szerkezetéből adódó enantioszelektivitás. Az enantioszelektivitás nagymértékben függ a reakciókörülményektől, és természetesen magától a reakcióközegtől is. Ionos folyadékokban az enzimek enantioszelektivitása jelentős mértékben megnőhet (Schöfer, 2001; Itoh, 2001; Kim, 2001). A kutatók közül legtöbben királis szekunder alkoholokat rezolváltak különböző lipázokkal, acil donorként vinil-acetátot alkalmazva (1.3.5. ábra).

O

1.3.5. ábra: Királis szekunder alkoholok lipázzal történő enantioszelektív észterezése (dinamikus rezolválása) vinil-acetáttal (Schöfer, 2001; Itoh, 2001; Kim, 2001)

Kragl és munkatársai az 1-feniletanol (R’ = Ph, R” = Me) enantioszelektív acilezését vizsgálták többféle lipázzal. (Schöfer, 2001). A kísérleteket metil-terc-butil-éterben (MTBE) és több imidazolium-bázisú ionos folyadékban is elvégezték. Candida

antarctica lipáz (Novozyme 435) esetén kiváló (> 98%) enantioszelektivitást tapasztaltak mind MTBE-ben, mind az ionos folyadékok egy részében. Érdekes, hogy míg [bmim]PF₆-ban és [bmim]BF₄-ben igen alacsony konverziót figyeltek meg, addig [bmim]CF₃SO₃-ban és [bmim]Tf₂N-ben a konverzió elérte az 50%-ot (a dinamikus rezolválási reakciók során elérhető maximum), ami meghaladta a MTBE-ben elért 43%-ot. Pseudomonas cepacia sp. lipáz alkalmazásával [bmim]CF₃SO₃-ban és [bmim]Tf₂ N-ben, Alcaligens sp. lipáz esetén pedig [omim]BF4-ben tapasztaltak MTBE-ben mért értéket lényegesen meghaladó, kiváló (> 98%) enantioszelektivitást.

Itoh és munkatársai egy hasonló, telítetlen szekunder alkohol dinamikus rezolválását végezték ionos folyadékokban (Itoh, 2001). Esetükben R’ = -C2H5Ph, R” = -CH=CH2, a biokatalizátor Candida antarctica lipáz (Novozyme 435) volt. Az ionos folyadékok közül a legmagasabb hozamot (49%) [bmim]PF6-ban tapasztalták. A [bmim]BF4-ben mért hozam (44%) gyakorlatilag megegyezett a di-izopropil-éterben mért értékkel. Az enantioszelektivitás az ionos folyadékokban kiváló (ee(R) > 99%) volt. Az enzimet tartalmazó ionos folyadékot további reakcióciklusokban sikeresen újra felhasználták, habár az újrahasznosítás során az enzim aktivitása kismértékben csökkent.

Kim és munkatársai számos szekunder alkohol rezolválását elvégezték szerves oldószerekben (tetrahidro-furán = THF, toluol) és ionos folyadékokban (Kim, 2001).

Ennek során ionos folyadék reakcióközegben lényegesen jobb enantioszelektivitást tapasztaltak minden szubsztrátum esetében (1.3.2. táblázat).

Lipázokkal nemcsak szén, hanem foszfor kiralitáscentrummal rendelkező vegyületek is jó enantioszelektivitással rezolválhatók. Kiełbasiński és munkatársai racém P-királis hidroximetanofoszfinátok és hidroximetilfoszfin-oxidok kinetikus rezolválását vizsgálták [bmim]BF₄-ben illetve [bmim]PF₆-ban (1.3.6. ábra).

P

1.3.6. ábra: P-királis vegyületek lipázos rezolválása vinil-acetáttal ionos folyadékban (Kiełbasiński, 2002)

A reakció mindkét ionos folyadékban lejátszódott, és a [bmim]PF₆-ban tapasztalt enantioszelektivitás az összes vizsgált szubsztrátum esetben meghaladta a szerves oldószerben mért értéket (Kiełbasiński, 2002).

1.3.2. táblázat: Különböző szekunder alkoholok rezolválása ionos folyadékokban és szerves oldószerekben (Kim, 2001)

Az enzimeknek nemcsak az enantio-, hanem regioszelektivitása is jelentősen növekedhet, ha a hagyományos szerves oldószer helyett ionos folyadék reakcióközeget alkalmazunk. Park és Kazlauskas a glükóz acilezése során (1.3.7. ábra) 1-metoxietil-3-metilimidazolium tetrafluoro-borát ([moemim]BF4) ionos folyadékban 93%-os szelektivitást tapasztalt, míg THF-ben a szelektivitás és a reakciósebesség is igen alacsony volt (Park és Kazlauskas, 2001). A hozam mindkét oldószer esetén elérte a 99%-ot. A jobb szelektivitás oka valószínűleg az, hogy a glükóz THF-ben lényegesen kevésbé oldódik, mint a monoacilezett termék, ennél fogva ez utóbbi jelentős része

1 „E” érték definíciója a „Definíciók és rövidítések” fejezetben található

további acilezésen megy keresztül. A [moemim]BF₄-ben viszont a glükóz is jól oldódik, ennek következtében a reakció gyorsabban és lényegesen szelektívebben játszódik le. A szerzők hasonlóan sikeresen acilezték a diszacharid maltózt is [moemim]BF₄-ben (Park és Kazlauskas, 2001).

1.3.7. ábra: D-glükóz szelektív acilezése ionos folyadékban (Park és Kazlauskas, 2001)

Nemcsak a cukrokhoz hasonló hidrofil, hanem erősen hidrofób anyagok, például zsírok is jól oldódnak megfelelő ionos folyadékokban. Zsírok és olajok glicerolízisével monogliceridek állíthatók elő (1.3.8. ábra, A), melyek fontos adalékanyagok az élelmiszer-, a gyógyszer- illetve a kozmetikai iparban. Már korábban leírták, hogy a hagyományos, ipari méretekben végzett glicerolízis során a szelektivitás igen alacsony (40-60% MG hozam a glicerinfeleslegtől függően, di-és triglicerid melléktermékek mellett), az erélyes reakciókörülmények (220-250 °C, alkálikus katalizátor…) miatt, így további energiaigényes tisztítási lépésre (pl. vákuumdesztilláció) van szükség (Sonntag, 1982). Nem-konvencionális közegben végzett enzimes glicerolízis enyhébb körülmények mellett (40-50 °C), lényegesen magasabb szelektivitással (90%) kivitelezhető (Bornscheuer, 1995), ami többek közt a glicerin-monosztearát enzimes szintézisére is igaz (Fráter, 2005). Az enzimes reakciók során ideálisnak bizonyult oldószerek (aceton, terc-butanol) azonban erősen illékony, környezetkárosító anyagok.

Elsőként Guo és Xu találtak olyan ionos folyadékot, ami alkalmas mind a zsírok/olajok, mind a glicerin és a monogliceridek egyidejű oldatban tartására (Guo és Xu, 2005). A trigliceridek ugyanis nem elegyednek a „hagyományosan” alkalmazott [bmim]PF₆ [bmim]BF₄ vagy [bmim]Tf₂N ionos folyadékokkal, azonban egy speciális, extra hosszú oldalláncokat tartalmazó ammóniumbázisú ionos folyadékkal igen. Guo és Xu tetradecil-di-pentaetoxi-metil-ammónium metil-szulfát ([tppmN]MeSO₄, 1.3.8. ábra, B) ionos folyadékban sikeresen hajtotta végre különböző olajok glicerolízisét különböző lipázokkal (Novozyme 435, Lipozyme IM). A két enzim közül a Novozyme 435-ben

(Candida antarctica lipáz) tapasztaltak magasabb konverziót. Az alkalmazott ionos folyadékban mind a triglicerid, mind a glicerin, mind a monoglicerid jól oldódott: a triglicerid a hosszú, apoláros oldalláncok miatt („hasonló a hasonlóban oldódik” elv szerint), míg a glicerin és a monogliceridek a glicerin szabad –OH csoportja és a polietoxilánc oxigénje között létrejövő hidrogénhíd következtében (1.3.8. ábra, C). Az ionos folyadékban végzett glicerolízis során mintegy 90% monoglicerid hozamot értek el, ami meghaladta az aceton reakcióközegben tapasztalt értékeket. Ennek a szerzők szerinti magyarázata az, hogy a monoglicerid láncvégi „szabad” –OH csoportjának hidrogénkötéssel való „lekötése” csökkenti a monoglicerid di-illetve trigliceriddé történő visszaalakulását, azaz az 1.3.8. ábra A részén látható 1. egyenletben az egyensúlyt a monoglicerid képződése felé tolja el (Guo és Xu, 2005).

H₂₉C₁₄

-1.3.8. ábra: Trigliceridek glicerolízise (A), a [tppmN]MeSO4 szerkezete (B), és a kation oxigén és monoglicerid (glicerin) közötti hidrogénhíd (C). Rövidítések: TG = triglicerid, DG = diglicerid, MG = monoglicerid, Gly = glicerin (Guo és Xu, 2005)

In document Ionos folyadékok alkalmazása katalitikus reakciók közegeként (Pldal 37-46)