A VRN1 vernalizációs gén és a CBF-COR rendszer kölcsönhatásának vizsgálata deléciós mutáns alakor vonalban
Az elınevelés (20 °C) során a VRN1 gént érintı deléciós mutációt hordozó MVP-2 Triticum monococcum vonalhoz tartozó homozigóta recesszív mutáns (mvp/mvp), valamint a vad allélt legalább egy kópiában tartalmazó (Mvp/-) növényeket egyedenként végzett genotipizálással azonosítottuk, majd az elınevelést követıen alacsony hımérsékleten (4 °C) edzettük. Az elınevelés és az edzés végén ellenıriztük a VRN1 gén aktivitásának szintjét, valamint a hajtáscsúcs fejlıdési állapotának változását a két csoportban. Meghatároztuk mutáns és vad növényekben kontroll körülmények között, illetve rövid (8 órás), de az irodalmi adatok alapján már indukciós hatású hidegkezelést követıen az FR-2 lókuszon elhelyezkedı CBF2, CBF3, CBF4, CBF9, CBF10, CBF12, CBF13, CBF14, CBF15, CBF16 és CBF17 gének, valamint hosszabb távú (12 napos) hidegkezelés alatt a folyamatban downstream helyzető, késıbb indukálódó COR14b effektor gén expressziós aktivitását.
Hosszabb távú (18 napos) hidegedzést követıen a növényeket fagytesztnek vetettük alá, amit -9, -12 és -13 °C-on is megismételtünk. Az ellenállóképességet 2 hét regenerációt követıen egyedenkénti bonitálási érték adásával, valamint a csoportokra vonatkozó túlélési ráta számításával határoztuk meg. A fagytesztet megelızıen, illetve azt követıen az esetleges szöveti sérülések kimutatásának céljából monitoroztuk a növények levelének ionkiáramlási értékét (relatív konduktancia mérés), valamint a fotoszintetikus apparátus mőködési hatékonyságát jellemzı indukált fluoreszcencia értékét (a PSII fotokémiai rendszer maximális kvantumhatékonyságával korreláló Fv/Fm paraméter meghatározása).
Vizsgálataink alapján a növények hajtáscsúcsa az elınevelési periódus alatt a két különbözı genetikai hátterő csoportban végig vegetatív állapotban maradt (6A Ábra). A hidegedzési periódus végére a vad (Mvp/-) növények hajtáscsúcsa a kettıs befőzıdés fázisába került, tehát elindult a generatív átalakulás útján, a homozigóta recesszív mutáns (mvp/mvp) növényekben azonban továbbra is vegetatív állapotban maradt (6A Ábra). A VRN1 gén expressziós aktivitása vad típusú növényekben kontroll körülmények között minimális, míg hidegedzés hatására ötszörösére növekszik. Ezzel szemben mutáns növényekben a hidegkezelés hatására sem volt kimutatható a VRN1 gén aktivitása (6B Ábra). Ez a gén RNS termékének analízisén alapuló vizsgálat egyben a sejtmagi DNS analízisén alapuló genotipizálás helyességének ellenırzésére is szolgált, eredménye azt megerısíti.
6. Ábra
A: Homozigóta recesszív mutáns (mvp/mvp) és vad (Mvp/-) Triticum monococcum növények hajtáscsúcsairól készült reprezentatív felvételek az elınevelési periódus (20 °C) és a 18 napos hidegedzési periódus (4 °C) végén.
Jelmagyarázat: dr = double ridge: kettıs befőzıdés. (Zeiss sztereomikroszkóp segítségével, Canon PowerShot G6 készülékkel 5x optikai zoom mellett készített fényképek).
B: A VRN1 gén homozigóta recesszív mutáns (mvp/mvp) és vad (Mvp/-) Triticum monococcum növények levélmintáiban mérhetı expressziós aktivitása az elınevelési periódus (20 °C), valamint a 18 napos hidegedzési periódus (4 °C) végén real-time PCR analízis (relatív kvantifikáció: 2-∆∆Ct módszer) alapján: átlag ± szórás (standard error). Biológiai ismétlések száma: 3. Endogén kontroll: β-AKTIN. Kalibrátor: adott genetikai hátterő kontroll (20 °C) minták. Statisztika: az összes vizsgált csoport összehasonlítása egyutas ANOVA, majd Tukey-féle post-hoc teszt analízis alapján (p<0,05). Az ugyanazon betőjelzéssel ellátott oszlopok által reprezentált adatok nem különböznek egymástól szignifikánsan.
A VRN és a CBF rendszer kölcsönhatásának vizsgálata céljából meghatároztuk az FR-2 lókuszon elhelyezkedı CBF gének expressziós aktivitásának változását rövid ideig tartó hidegedzés hatására (7. Ábra). Az elınevelés (20 °C) alatt egyik CBF gén sem mutatott számottevı aktivitást, rövid ideig tartó hidegkezelés hatására azonban megnıtt az expressziójuk. Legjobban a CBF14 gén expressziója ugrott meg, de a kontroll körülmények között győjtött mintákban mérhetı értékhez képest jóval magasabb aktivitást mutatott a CBF4, CBF9, CBF12, CBF13, CBF15, CBF16 és CBF17 gén is. Ezek közül a CBF4, CBF9, CBF12, CBF14 és CBF17 gének hidegkezelés hatására mutatott mőködése tért el szignifikánsan a mutáns és a vad csoportban: a felsorolt gének aktivitása a mutánsokban jóval magasabb volt.
7. Ábra Az FR-2 lókuszon elhelyezkedı CBF gének homozigóta recesszív mutáns (mvp/mvp) és vad (Mvp/-) Triticum monococcum növények levélmintáiban mérhetı expressziós aktivitása az elınevelési periódus (20 °C) végén, valamint 8 órás hidegedzést (4 °C) követıen real-time PCR analízis (relatív kvantifikáció: 2-∆∆Ct módszer) alapján: átlag ± szórás (standard error). Biológiai ismétlések száma: 8. Endogén kontroll: β-AKTIN. Kalibrátor:
adott genetikai hátterő kontroll (20 °C) minták. Statisztika: mutáns és vad csoportok összehasonlítása edzést követıen egyutas ANOVA módszerrel: * p<0,05; ** p<0,01.
Az effektor gének expressziós szintjének és aktivációs profiljának meghatározása céljából vizsgáltuk a COR14b gén expressziós aktivitásának hosszabb távú hidegedzés során bekövetkezı változását (8. Ábra). Azt tapasztaltuk, hogy már 8 órás hidegkezelés hatására is megemelkedik a gén aktivitása, ám maximális értékét, ami a 8 órás szint mintegy négyszerese (mutáns növényekben tízszerese), 32 órás edzést követıen éri el. Ettıl kezdve lassabb ütemben, de folyamatosan csökken az expresszió. A maximális érték elérésekor, majd a lecsengés fázisában szignifikáns különbség figyelhetı meg a mutáns és vad növények között:
a mutánsokban a gén expressziós szintje legalább háromszorosa a vad növényekhez képest.
8. Ábra A COR14b gén expressziós profilja homozigóta recesszív mutáns (mvp/mvp) és vad (Mvp/-) Triticum monococcum növények levélmintáiban hosszabb távú hidegedzés során a hidegkezelés kezdetekor, valamint 8 és 32 órás, illetve 4 és 12 napos edzést követıen real-time PCR analízis (relatív kvantifikáció: 2-∆∆Ct módszer) alapján: átlag ± szórás (standard error). Biológiai ismétlések száma: 8. Endogén kontroll: β-AKTIN. Kalibrátor:
adott genetikai hátterő kontroll (20 °C) minták. Statisztika: mutáns és vad csoportok összehasonlítása idıpontonként egyutas ANOVA módszerrel: * p<0,05; ** p<0,01.
Az mvp mutáció fenotípusos jellegekre gyakorolt hatását nem csupán a hajtáscsúcs VRN1 gén mőködéséhez köthetı morfológiai változásának monitorozásával követtük nyomon, hanem olyan tulajdonságokat is megvizsgáltunk, amelyek kialakulása a CBF-COR rendszer mőködéséhez köthetı. Ilyen komplex tulajdonság a növények fagyállósága, amit fagytesztet követıen, egyedenkénti bonitálási érték adásával és a csoportokra vonatkoztatott túlélési ráta meghatározásával, valamint fiziológiai paraméterek felvételével jellemeztünk.
A túlélési ráta -9 °C-os fagyasztást követıen mindkét, különbözı genetikai hátterő csoportban 100 %-os volt (9A Ábra), ám a bonitálási értékben már ezen a hımérsékleten is megfigyelhetı különbség a mutánsok javára (9B Ábra), tehát ezek a növények kevésbé károsodtak, nagyobb regenerációs kapacitást mutattak, mint a vad csoport. Ez az eltérés -12
°C-os fagyasztásnál az átlagos bonitálási értékek mellett már a túlélési rátában is megmutatkozik: míg a mutáns növények mintegy 70 %-a élte túl a fagytesztet, addig a vadaknak kevesebb, mint 40 %-a (9A Ábra). A -13 °C-on végzett fagyteszt során mindkét növénycsoport egyedei elpusztultak.
9. Ábra Hidegedzett (4 °C, 18 nap) homozigóta recesszív mutáns (mvp/mvp) és vad (Mvp/-) Triticum monococcum növények -9, -12 és -13 °C-on kivitelezett fagytesztjét, majd 2 hetes regenerációját követıen mérhetı túlélési ráták (A) és bonitálási értékek (B): átlag ± szórás (standard error). Ismétlések (ládánként összesített adatsorok) száma: 3. Bonitálási érték (0-5): 0 = teljesen kipusztult növény, 5 = károsodást nem szenvedett, nagy mértékő regenerációt mutató, egészséges növény. Túlélési ráta: 2-5 bonitálási értéket kapott növények százaléka adott genetikai hátterő csoporton belül. Statisztika: az összes vizsgált csoport összehasonlítása egyutas ANOVA, majd Tukey-féle post-hoc teszt analízis alapján (p<0,05). Az ugyanazon betőjelzéssel ellátott oszlopok által reprezentált adatok nem különböznek egymástól szignifikánsan.
A levelek elfagyás következtében kialakuló szöveti sérüléseinek mértékével korreláló ionkiáramlás mértékét relatív konduktancia méréssel határoztuk meg (10A Ábra). Ez a paraméter nem változott számottevıen az elınevelés és a hidegedzés idıszaka alatt, a -9 °C-on végzett fagyasztás sem volt rá szignifikáns hatással, bár a hımérséklet csökkenésével megfigyelhetı egy tendenciózus, enyhe emelkedés az értékében. A -12 °C-on végzett fagyasztás vad növények esetében már szignifikáns növekedést eredményezett a nevelési idıszakban mért értékekhez képest. A mutánsok szintén sérültek ezen a fagyasztási hımérsékleten, ám kisebb mértékben. A -13 °C-on végzett fagyasztás hatására az ionkiáramlási érték mindkét csoportban megközelítette a maximális szintet, de szignifikáns különbséget tudtunk kimutatni a mutáns és vad növények értékei között: elıbbiek kevésbé károsodtak a fagyasztás hatására.
Az indukált fluoreszcencia változó és maximális komponensének hányadosa (10B Ábra) a hidegedzés során mindkét csoportban enyhén lecsökkent az elınevelési periódusban mért értékekhez képest, ám a mutáns és vad növények között nem volt különbség. A -9 és -12
°C-on végzett fagyasztás nem volt hatással egyik csoportra sem, ám a -13 °C-os fagyasztást követıen mind a mutáns, mind a vad növények esetében számottevıen lecsökkent az Fv/Fm paraméter értéke. A csökkenés vad növényekben szignifikánsan nagyobb volt, a mutáns növények kevésbé károsodtak.
10. Ábra Homozigóta recesszív mutáns (mvp/mvp) és vad (Mvp/-) Triticum monococcum növények relatív konduktancia (a maximális ionkiáramlás százalékában) (A) és indukált fluoreszcencia (Fv/Fm) (B) értékei az elınevelési periódus (20 °C) és 18 napos hidegedzési periódus (4 °C) végén, valamint -9, -12 és -13 °C-on végzett fagyteszteket követıen 16 órával: átlag ± szórás (standard error). A biológiai ismétlések száma a relatív konduktancia mérés esetén 10, az indukált fluoreszcencia mérése esetén 25. Statisztika: az összes vizsgált csoport összehasonlítása egyutas ANOVA, majd Tukey-féle post-hoc teszt analízis alapján (p<0,05). Az ugyanazon betőjelzéssel ellátott oszlopok által reprezentált adatok nem különböznek egymástól szignifikánsan.
A CBF-COR rendszer mőködési sajátosságainak vizsgálata dedifferenciált árpa szövettenyészetekben
Kallusz kultúrákat állítottunk elı érett fagytőrı ıszi árpa (Hordeum vulgare, L. cv. Nure) embriókból, melyekbıl dedifferenciált, kettes típusú, embriogén tenyészeteket hoztunk létre.
A kísérletek során összehasonlítottuk a kallusz, illetve intakt növényi rendszer génexpressziós mőködését CBF és COR14b génekre nézve, valamint vizsgáltuk a szintetikus auxinanalóggal kezelt, illetve kezeletlen tenyészetekben hidegedzés hatására kialakuló génexpressziós és hormonális különbségeket, illetve az ezek hatására bekövetkezı fenotípusos változásokat, valamint a fagyállóság mértékét.
Elsıként megvizsgáltuk, hogy a CBF és COR gének hidegindukált aktivációjának mintázata (idıbeli változásának profilja) mennyiben különbözik intakt csíranövények hajtáscsúcsot tartalmazó bokrosodási csomójából, valamint szövettenyésztési kontroll körülmények között (24 °C-on, megvilágítás nélkül, mesterséges auxinanalóg alkalmazása mellett) nevelt, dedifferenciált kallusz kultúrákból származó mintákban. Ehhez az elıkísérletek során szemikvantitatív PCR módszerrel teszteltük, hogy az árpa CBF1, CBF2, CBF3, CBF4, CBF5, CBF6, CBF7, CBF9, CBF11, CBF12, CBF13, CBF14, valamint COR14b gének közül melyik mutat hideg hatására megnövekedett expressziót az általunk használt árpa genotípusban. Az elıkísérleteink eredményei, valamint irodalmi adatok alapján a real-time PCR módszerrel végzett analízishez CBF gének közül a CBF9 és a CBF14 gént, valamint a COR14b gént választottuk ki, mert ezek mutatták a legerıteljesebb hidegindukciót. A real-time PCR analízis során kapott eredményeink azt mutatják, hogy a fényen nevelt csíranövények és a sötétben fenntartott kallusz tenyészetek génexpressziós mintázata összevethetı egymással, a vizsgált gének hidegindukált aktivációjának kinetikája hasonló a két rendszerben (11. Ábra).
A csíranövények bokrosodási csomóiban a CBF gének expressziója gyors, tranziens növekedést mutatott a hidegkezelés megkezdését követıen, a maximumot 6-12 órás edzés hatására érte el 10-50-szeres expressziós különbséggel a kontroll körülmények között nevelt növények értékeihez képest, majd 48 órával a kezelés kezdetétıl számítva lecsengett (11A, 11C Ábra). Kalluszban a CBF9 gén indukciója nagyon hasonló kinetikát mutatott a bokrosodási csomókból származó minták esetében tapasztalthoz, bár az indukció mértéke alacsonyabb volt (11B Ábra). CBF14 gén esetén kalluszban az indukció késıbb volt kimutatható, de a maximumot a csíranövénybıl származó minták értékeihez hasonlóan 12 órás hidegkezelés hatására érte el, s 48 órás edzést követıen hasonló lecsengést mutatott. Az expressziós értékek ennél a génnél is nagyságrendileg megegyeznek a kallusz és csíranövény mintákban, de kalluszban alacsonyabbak (11D Ábra). A COR14b gén aktivációja szintén nagyon hasonló karakterisztikát mutat kalluszban és csíranövények bokrosodási csomóiban: a hidegkezelés 12. órájától kezdve erıteljes emelkedés figyelhetı meg, ami 48 órás edzést követıen éri el a maximumot, ám kalluszban a gén expressziója nagyságrendekkel kisebb mértékő a csíranövények esetén kapott értékekhez képest (11E, 11F Ábra).
11. Ábra CBF9 (A, B), CBF14 (C, D) és COR14b (E, F) gének expressziós aktivitása a 2, 4, 6, 12, 24 és 48 órás hidegedzést (4 °C) követıen árpa csíranövények bokrosodási csomóiban (A, C, E), illetve kallusz tenyészeteiben (B, D, F) real-time PCR analízis (relatív kvantifikáció: 2-∆∆Ct módszer) alapján: átlag ± szórás (standard error).
Biológiai ismétlések száma: 3. Endogén kontroll: β-AKTIN. Kalibrátor: adott idıpontban vett kontroll minta (24
°C). Statisztika: az összes vizsgált csoport összehasonlítása egyutas ANOVA, majd Tukey-féle post-hoc teszt analízis alapján (p<0,05). Az ugyanazon betőjelzéssel ellátott oszlopok által reprezentált adatok nem különböznek egymástól szignifikánsan.
Mivel a kallusz kultúrák és az intakt csíranövények bokrosodási csomóinak összehasonlítása azt az eredményt adta, hogy a két rendszerben összevethetı a CBF és COR gének mőködése, azok hidegindukált aktivációjának kinetikája hasonló, részletesebb elemzésnek vetettük alá e gének dedifferenciált kallusz kultúrákban mutatott expressziós aktivitását. Ezeknek a kísérleteknek a megtervezésénél már azt is figyelembe vettük, hogy a kalluszindukcióhoz, valamint a tenyészetek fenntartásához nagy dózisban használtunk szintetikus auxinanalógot (Dicamba), ami módosíthatja a génmőködést és a fiziológiás válaszreakciókat. Ezért a dedifferenciált, kettes típusú, embriogén tenyészetek létrehozását követıen kialakítottunk
olyan tenyészeteket is, melyeket Dicamba-mentes táptalajon tartottunk fenn (Dic(-) kultúrák).
A Dicamba-mentesítés eredményességét az exogén auxinanalóg koncentrációjának mérésével ellenıriztük a tenyészetekben. Dic(-) kultúrákban 16,52 ± 2,59 pmol / g frisstömeg (átlag ± szórás: standard error) volt ez az érték, míg a továbbra is Dicambával kezelt táptalajon fenntartott (Dic(+)) kultúrákban 10757,84 ± 1449,31 pmol / g frisstömeg, tehát a Dicamba eltávolítását a Dic(-) tenyészetekbıl sikeresnek tekintettük. A különbözı Dicamba-tartalmú táptalajon nevelt tenyészetek között sem makroszkópikus, sem mikroszkópikus különbségeket nem tudtunk detektálni, látható fenotípusos jellegeik (pl. morzsalékos struktúra) sem változtak meg. Mivel egy növekedési hormon, az auxin analógjának hatását vizsgáltuk, meghatároztuk a Dicambával kezelt és kezeletlen kultúrák növekedési rátáját is a kiindulási tömeghez képest, egy hét tenyésztést követıen. Ez az érték a várakozásainkkal ellentétben szintén egyforma volt a Dic(-), illetve Dic(+) kultúrákban: 175 ± 14 % (átlag ± szórás: standard error) 24 °C-on, valamint 148 ± 18 % 4 °C-on.
A Dicamba-kezelés hatását a kiválasztott CBF és COR gének expressziójára elıször kontroll körülmények között (24 °C) vizsgáltuk Dic(+) és Dic(-) kultúrákban (12A Ábra). Azt az eredményt kaptuk, hogy az alap génexpressziós szintet tekintve a három vizsgált gén esetében nincs számottevı különbség a Dicambával kezelt és Dicamba-mentes kultúrák között, bár CBF gének esetén Dic(+) kultúrákban kicsivel magasabb az expresszió szintje a Dic(-) kultúrákhoz képest (12A Ábra).
Az exogén auxinanalóg CBF és COR gének hidegindukált aktivációjára és annak kinetikájára gyakorolt hatásának vizsgálata céljából meghatároztuk a gének expressziós szintjét a maximális indukciót adó, rövid (12 és 24 órás), illetve hosszabb távú (4 és 7 napos) hidegedzést (4 °C) követıen. A CBF9 gén esetén nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget a Dic(+) és Dic(-) kultúrák között (12B Ábra). CBF14 (12C Ábra) és COR14b (12D Ábra) esetében azonban a Dic(-) kultúrák rövid ideig tartó hidegkezelés hatására jóval alacsonyabb expressziós értékeket mutattak, bár az indukció kinetikája ezeknél a géneknél is megegyezett a Dic(+) tenyészetek esetén mutatott lefutással, s a rövid ideig tartó hidegkezelés által kiváltott aktivációjuk is egyértelmően kimutatható volt. Hosszabb távú edzés alatt mindhárom gén aktivitása erıteljes lecsengést mutatott (12B, 12C, 12D Ábra). Az eredmények egyben megerısítik a korábbi, kallusz kultúrák és csíranövény bokrosodási csomók összehasonlítása során Dic(+) kallusz tenyészetekre kapott adatokat (11 Ábra).
12. Ábra (ld. 45. oldal)
A: CBF9, CBF14 és COR14b gének expressziós aktivitása kontroll körülmények között (24 °C, sötét, Dicambás kezelés) nevelt árpa kalluszokban real-time PCR analízis (relatív kvantifikáció: 2-∆∆Ct módszer) alapján: átlag ± szórás (standard error). Biológiai ismétlések száma: 3. Endogén kontroll: β-AKTIN. Kalibrátor: Dicamba-mentes kontroll minták.
CBF9 (B), CBF14 (C) és COR14b (D) gének expressziós aktivitása Dicambával kezelt (Dic(+)) és Dicamba-mentes (Dic(-)) árpa kallusz kultúrákban rövid (12 és 24 órás), valamint hosszabb távú (4 és 7 napos) hidegedzést (4 °C) követıen real-time PCR analízis (relatív kvantifikáció: 2-∆∆Ct módszer) alapján: átlag ± szórás (standard error). Biológiai ismétlések száma: 3. Endogén kontroll: β-AKTIN. Kalibrátor: adott idıpontban vett, megfelelı Dicamba kezeléső kontroll minták (24 °C). Statisztika: az összes vizsgált csoport összehasonlítása egyutas ANOVA, majd Tukey-féle post-hoc teszt analízis alapján (p<0,05). Az ugyanazon betőjelzéssel ellátott oszlopok által reprezentált adatok nem különböznek egymástól szignifikánsan.
A CBF9, CBF14 és COR14b gének hidegindukciójának kallusz kultúrákban meghatározott sajátosságai az intakt növényre jellemzı, alapvetı sejtes válasz mőködésére engednek következtetni dedifferenciált szöveti kultúrákban is. Az általunk alkalmazott, speciális rendszer hidegakklimációs mechanizmusának további vizsgálata céljából ezért meghatároztuk az intakt növényi rendszereknél vizsgált, a hidegakklimációs folyamatok sikeressége szempontjából legfontosabb fenotípusos jelleget, a fagytőrés mértékét is kallusz kultúrákban.
Ehhez jelentıs mértékben módosítanunk kellett a növények esetén használt protokollt, valamint új teszteket kellett meghonosítanunk a rendszer fagyteszt utáni életképességének mérésére.
A kísérletekben a kallusz tenyészeteket 4 °C-on, sötétben edzettük. Az edzés a CBF gének expressziójának mérésekor használt beállításokhoz képest hosszabb ideig (4 és 7 napig) tartott annak érdekében, hogy a génexpressziós változások következtében kialakuló fenotípusos hatások kifejezıdhessenek, mérhetı szinten megjelenjenek. A kallusz tenyészetek túlélési képességét a fagyállóság két különbözı komponensének vizsgálatával, a sejtes életképességet mérı TTC teszttel, valamint a tenyészetek fagytesztet követıen mutatott tömegnövekedési rátáját mérı regenerációs teszttel határoztuk meg. 4 napos edzést követıen még nem tudtuk kimutatni az edzés fagyállóságra gyakorolt pozitív hatását a kontroll körülmények között tartott kultúrákhoz képest, a Dic(+) és Dic(-) tenyészetek között sem alakult ki számottevı különbség, mindegyik minta kifagyott (13. Ábra). 7 napos hidegkezelést követıen azonban mindkét teszt eredménye azt mutatta, hogy az edzés eredményes volt, a kultúrák fagyállósága megnövekedett a 24 °C-on nevelt kontrollhoz képest (13. Ábra). 7 napos hidegkezelés hatására különbséget tudtunk kimutatni az eltérı Dicamba-kezeléső csoportok között is: a Dic(+) kultúrák jóval magasabb életképességi értéket és regenerációs rátát mutattak a Dic(-) kultúráknál, tehát elıbbiek fagytőrı képessége magasabb volt.
13. Ábra Dicambával kezelt (Dic(+)) és Dicamba-mentes (Dic(-)), kontroll körülmények között (24 °C) nevelt, illetve 4 és 7 napig hidegedzett (4 °C) árpa kallusztenyészetek fagytesztet (-4 °C) követıen mérhetı relatív életképessége TTC teszt alapján (A), valamint relatív regenerációs rátája (B) a megfelelı kezeléső, de nem fagyasztott minták értékeinek százalékában: átlag ± szórás (standard error). Biológiai ismétlések száma: 3.
Statisztika: az összes vizsgált csoport összehasonlítása egyutas ANOVA, majd Tukey-féle post-hoc teszt analízis alapján (p<0,05). Az ugyanazon betőjelzéssel ellátott oszlopok által reprezentált adatok nem különböznek egymástól szignifikánsan.
A kalluszindukcióhoz, illetve a tenyészetek fenntartásához használt, viszonylag magas koncentrációban alkalmazott exogén auxinkezelés természetszerően hatással lehet a kallusz sejtek hormonháztartására is. Ezért megvizsgáltuk, hogyan változik a fontosabb, auxin-anyagcserével kapcsolatban álló, valamint a hidegstresszre adott válaszok kialakításában, szabályozásában kulcsszerepet betöltı endogén hormonok koncentrációja a Dicamba-kezelés függvényében.
Elsıként kontroll körülmények (24 °C) között nevelt kultúrákban vizsgáltuk a hormonkoncentrációkat Dic(+) és Dic(-) kultúrákban (2. Táblázat). Az elızetes várakozásainkkal ellentétben az endogén auxin (IAA) koncentrációja nem különbözött számottevıen az eltérı Dicamba-kezeléső kultúrákban, azonban biológiailag inaktív származékai (IAA-Asp, IAA-GE) alacsonyabb koncentrációban voltak jelen a Dicambával kezelt kultúrákban a Dicamba-mentesekhez képest. A stresszhormonként is számontartott szalicilsav (SA) koncentrációja valamivel magasabb volt Dic(+) kultúrákban, a szintén stresszhormon szerepet is betöltı jazmonsav (JA) és abszcizinsav (ABA) koncentrációja
pedig 3-4-szerese volt a Dic(-) kultúrákban mérhetı értékeknek. Az abszcizinsav katabolitjai közül a dihidro-fazeinsav (DPA) mennyiségében nem mértünk különbséget az eltérı Dicamba-kezeléső kultúrákban, ám a fazeinsav (PA), valamint a neofazeinsav (Neo-PA) koncentrációja Dic(+) tenyészetekben közel háromszorosa volt a Dic(-) kultúrákban mérhetı értékekhez képest.
2. Táblázat Az endogén hormonok átlagos koncentrációja (pmol / g frisstömeg) Dicambával kezelt (Dic(+)), illetve Dicamba-mentes (Dic(-)), kontroll körülmények között (24 °C) nevelt árpa kallusz tenyészetekben: átlag
± szórás: standard error.
Hormon Dic(-) kontroll Dic(+) kontroll IAA 5,02 ± 1,19 4,83 ± 1,31 IAA-Asp 550,18 ± 111,37 261,62 ± 32,03
IAA-GE 118,80 ± 23,56 38,64 ± 6,53 ABA 0,20 ± 0,04 0,91 ± 0,20 DPA 3,40 ± 0,82 3,37 ± 1,05
PA 0,12 ± 0,02 0,39 ± 0,07
Neo-PA 0,18 ± 0,10 0,50 ± 0,08 SA 191,09 ± 24,23 263,19 ± 37,46
JA 19,82 ± 6,53 58,54 ± 1,33
IAA: indol-3-ecetsav (auxin); IAA-Asp: IAA-aszpartát; IAA-GE: IAA-glükózészter; ABA: abszcizinsav; PA:
fazeinsav; DPA: dihidro-fazeinsav; Neo-PA: neofazeinsav; SA: szalicilsav; JA: jazmonsav.
Annak érdekében, hogy a fagyállóság fenotípusos jeleit is kialakító, hosszabb távú hidegedzés endogén hormonháztartásra gyakorolt hatását megvizsgáljuk, meghatároztuk a tenyészetek hormonkoncentrációját 4, illetve 7 napos hidegkezelést követıen is. A hidegkezelésre adott hormonális válasz nagyságát a kontroll körülmények között nevelt kultúrákban mérhetı értékek (2. Táblázat) százalékaiban határoztuk meg.
Az endogén auxin (IAA) mennyisége Dic(+) kultúrákban enyhén megnövekedett hidegkezelés hatására, azonban konjugáltjainak, az IAA-aszpartátnak (IAA-Asp) (14B Ábra), illetve az IAA-glükóz-észternek (IAA-GE) (14C Ábra) a koncentrációjában nem mutattunk ki számottevı változást. Dic(-) kultúrákban mindhárom vizsgált anyag kisebb koncentrációban volt jelen a Dic(+) tenyészetekhez képest (14. Ábra).
14. Ábra Az endogén auxin (indol-3-ecetsav (IAA)) (A), illetve származékainak, az IAA-aszpartátnak (IAA-Asp) (B) és IAA-glükózészternek (IAA-GE) (C) relatív koncentrációja Dicambával kezelt (Dic(+)) és Dicamba-mentes (Dic(-)) árpa kallusz kultúrákban 4 és 7 napos hidegedzést (4 °C) követıen a megfelelı kezeléső, kontroll körülmények között (24 °C) nevelt minták értékeinek százalékában: átlag ± szórás (standard error).
Biológiai ismétlések száma: 3. Statisztika: az összes vizsgált csoport összehasonlítása egyutas ANOVA, majd
Biológiai ismétlések száma: 3. Statisztika: az összes vizsgált csoport összehasonlítása egyutas ANOVA, majd