A VRN1 vernalizációs gén és a CBF-COR rendszer kölcsönhatásának vizsgálata deléciós mutáns alakor vonalban
A kísérletek során arra a kérdésre kerestük a választ, hogy a VRN1 merisztéma identifikációs faktor diszfunkciója milyen hatással van a hidegakklimációs folyamatok szabályozásában kulcsszerepet betöltı CBF-COR rendszer mőködésére, valamint hogy a vernalizációs gént érintı deléciós mutáció hogyan befolyásolja a hideghatásra adott molekuláris válaszokhoz köthetı fenotípusos változásokat.
A VRN1 gént is tartalmazó deléciós mutációt hordozó alakor vonal vizsgálatával diploid búzában is megerısítettük, hogy a VRN1 gén aktivitása és a hajtáscsúcs morfológiai állapota között szoros kapcsolat áll fenn. Kimutattuk, hogy a VRN1 vernalizációs válaszgén funkcionális kiesése alapvetıen befolyásolja, megakadályozza az apikális merisztémák elkötelezettségének hideghatásra bekövetkezı megváltozását.
Megállapítottuk, hogy az FR-2 lókuszhoz kapcsolható CBF4, CBF9, CBF12, CBF14 és CBF17 gének, valamint a COR14b effektor gén hidegindukált aktivációjára pozitív hatással van a VRN1 gén deléciója, tehát valószínősíthetjük, hogy ezen gének mőködésének szabályozásában szerepet játszik a VRN1 gén. A VRN1 transzkripciós faktor COR14b gén hidegindukált aktivációjára gyakorolt hatását hosszabb távú hidegedzés során felvett expressziós profiljának vizsgálata során is kimutattuk.
Fagytesztek kivitelezésével bebizonyítottuk, hogy a VRN1 gén deléciója nem csupán a CBF-COR rendszer génexpressziós mőködésére van hatással, hanem a hidegakklimácós folyamatok következtében kialakuló fenotípusos változásokat is befolyásolja: a mutáció megnövelte a fagyállóság mértékét. Ez arra enged következtetni, hogy bár a VRN1 gén a hidegakklimációban érintett szabályozó gének közül csak bizonyos alcsoportok mőködésére van hatással, ez elegendı az edzıdési folyamatok nagy mértékő módosításához.
Kimutattuk, hogy a VRN1 gén aktivitása – feltételezhetıen a CBF-COR rendszerre gyakorolt hatásával – befolyásolja a hidegakklimáció következtében kialakuló fagytőrésért felelıs bizonyos fiziológiai folyamatokat. Megállapítottuk, hogy a VRN1 gén deléciója növelte a vegetatív növényi részek ellenállóságát a membránok elfagyás következtében kialakuló diszfunkciójának következményeivel szemben: a mutáns növényekben a szöveti károsodás (plazmalemma, tonoplaszt sérülése) nyomán fellépı ionkiáramlás mértéke kisebb, a fotoszintetikus elektrontranszport lánc funkcionális aktivitását mérı Fv/Fm paraméter magasabb volt. Ezzel bizonyítottuk, hogy a vegetatív szövetekben lezajló hidegakklimációs folyamatok a VRN1 gén aktivitása általi gátlás alól felszabadulva hatékonyabban mennek végbe. Ez megerısíti azt a hipotézist, mely szerint a VRN1 gén meghatározó szereppel bír az említett folyamatok szabályozásában.
Eredményeink azt mutatják, hogy a homozigóta recesszív mutáns (mvp/mvp) növények nagyobb mértékő fagyállóságát egyrészt az okozza, hogy a hajtáscsúcsi merisztémák vegetatív mőködés felé történı elkötelezettségét a VRN1 gén funkcióvesztése
„befagyasztja”, lehetıvé téve az apikális regenerációs képesség megırzését, valamint hogy a VRN1 gén kiesése magasabb hidegakklimációs kapacitást eredményez mutáns növényekben a vad egyedekhez képest. Ennek az lehet a magyarázata, hogy a VRN1 gén aktivitásának hiányában a CBF-COR rendszer nem kerül annak gátló hatása alá, s így aktívabb mőködésbe léphetnek a vegetatív szervek fagyállóságának kialakításáért felelıs fiziológiai folyamatok.
Kimutattuk, hogy a VRN1 gén a hidegakklimáció kialakításában szerepet játszó szabályozó gének közül csak bizonyos alcsoportok mőködésére van hatással, míg mások aktivitását nem
befolyásolja. Ez a hatás azonban elegendı a hidegedzıdési folyamatok nagy mértékő módosításához.
A CBF-COR rendszer mőködési sajátosságainak vizsgálata dedifferenciált árpa szövettenyészetekben
A bemutatott munka célja az volt, hogy vizsgáljuk a hajtáscsúcs differenciálatlan, pluripotens merisztematikus sejtjeinek modellezésére potenciálisan alkalmas dedifferenciált embriogén sejtkultúrák viselkedését a hidegedzés során, s új információkat győjtsünk a hidegakklimációs folyamatok regulátor génjeinek mőködésérıl ebben a speciális növényi anyagban. Célunk volt annak vizsgálata is, hogy az árpa szövettenyésztés során használt szintetikus auxinanalóg milyen hatással van a fagyállóság kialakulására, valamint az endogén hormonrendszer mőködésére alacsony hımérsékleti stressz esetén. Mivel a nevelés és a kezelések végig sötétben zajlottak, a funkcionálisan aktív kloroplasztiszok kialakulása, valamint a fényérzékeléshez köthetı szignáltranszdukciós utak mőködése gátolt volt a tenyészetekben.
Emellett mivel a kallusz kultúrákat nem jellemzi differenciált szöveti felépítés, az intakt növényekre jellemzı szisztémás jelek zömét is ki tudtuk küszöbölni.
Kutatásunk során kidolgoztuk ıszi árpa dedifferenciált kallusz tenyészetébıl kialakított, kettes típusú merisztemoid kultúráinak szövettenyészeti, valamint fagytesztelési rendszerét. Kimutattuk, hogy a CBF9, CBF14 gének, valamint a COR14b effektor gén hidegindukált aktivációjának karakterisztikája hasonló csíranövények bokrosodási csomóiban, illetve kallusz tenyészetekben, ami az intakt növényre jellemzı, alapvetı sejtes válasz mőködésére enged következtetni dedifferenciált szöveti kultúrákban is. A COR14b indukció szintje kalluszban azonban alacsonyabb az intakt növényben mért értékekhez képest, ami a gén fénytıl függı expressziójával, illetve a termék funkionálisan aktív kloroplasztiszokhoz köthetı mőködésével állhat kapcsolatban. Rövid és hosszabb távú hidegkezelés hatásának vizsgálata során megállapítottuk, hogy a fent leírt jellegzetességekre a szövettenyésztés során használt exogén auxinanalóg nincs hatással, a hidegindukált génexpressziós válasz mértékét azonban növeli.
Hosszabb távú hidegedzés hatására kialakuló fagytőrés vizsgálata során megállapítottuk, hogy a kallusz tenyészetek edzhetık, a CBF-COR rendszer aktivációjának tehát az intakt növényi rendszerhez hasonlóan fenotípusos hatásai vannak. Auxinanalóggal történı kezelés esetén a fagyállóság mértéke magasabb volt, ami korrelál az ezeknél a tenyészeteknél megfigyelhetı magyasabb COR14b expressziós szinttel.
A tenyészetek hormonháztartásának hidegkezelésre adott válaszainak megértéséhez elıször megvizsgáltuk a szintetikus auxinanalóg hatását kontroll kultúrákban.
Megállapítottuk, hogy az exogén auxinanalóg kontroll körülmények között is növeli a fıbb stresszhormonok (abszcizinsav, szalicilsav, jazmonsav) mennyiségét a kultúrákban. Ezt figyelembe véve megvizsgáltuk a hormonösszetétel hidegkezelés során kialakuló változásait, és kimutattuk, hogy a hidegedzés érinti a kalluszok abszcizinsav anyagcseréjét. Az inaktív ABA katabolitok szintje hosszabb távú hidegedzés során, különösen exogén auxinanalóg jelenlétében, erısen megemelkedett, ami arra utalhat, hogy az abszcizinsav korábban magasabb koncentrációban volt jelen a tenyészetekben. Kontroll körülmények között azonban nem tapasztaltunk ilyen mértékő különbséget a Dicambával kezelt és a Dicamba-mentes kultúrák abszcizinsav-tartalmában. Az auxinanalóg alkalmazása nem módosította számottevıen az endogén auxinhomeosztázist sem. Jelenlétében viszont magasabb volt a megnövekedett fagyállóságot mutató, 7 napos hidegedzésen átesett növényekben mérhetı jazmonsavkoncentráció, ami a másodlagos anyagcsereutakat serkentı hatása miatt, valamint a tartós hideghatás hírvivıjeként, a CBF-COR rendszer aktivációjára „rásegítı” faktorként
befolyásolhatja az akklimációs folyamatokat. Mindezek alapján a Dicamba feltételezhetıen inkább koindukciós hatású, az anyagcsere általános serkentésével, mintsem speciális aktiváló szerepével magyarázhatók a Dicambával kezelt kultúrák jobb fagyállósági értékei, kifejezettebb hormonális változása. Ezt az is alátámasztja, hogy a CBF-COR rendszer vizsgált génjeinek expressziós alapszintjét, valamint az aktiváció karakterisztikáját nem befolyásolta számottevıen a szintetikus auxinanalóg alkalmazása.
Eredményeink azt támasztják alá, hogy a rendszer alkalmas lehet további kísérletek kivitelezésére gabonafélék alapszintő, sejtes hidegválaszának vizsgálatára. A kallusz kultúrák és csíranövények bokrosodási csomóinak génexpressziós válaszában kimutatható eltéréseket valószínőleg az eltérı szöveti, fiziológiai és biokémiai környezet okozza, ami a hajtáscsúcsban biztosítja a hidegakklimációs folyamatok maximális szintjének elérését biztosító hormonok, metabolitok és aktiváló faktorok optimális koncentrációját. A reakciók kalluszban azonban a szisztémás és fényindukált jelátviteli utak, valamint a kloroplasztiszhoz köthetı faktorok aktiválása nélkül is az intakt növényekben megfigyelhetı karakterisztika szerint mennek végbe, ami egy általános, genotípusra jellemzı, sejt szintő hidegválasz mőködésére enged következtetni a növényi szervezetben. Kallusz kultúrákban ugyanakkor a hideg hatására bekövetkezı molekuláris változások kevésbé erıteljesek, a stresszválaszok maximális szintjének eléréséhez valószínőleg egyéb faktorok is szükségesek.