A téma aktualitása, jelentısége
A környezet hımérsékletének rövid- és hosszabb távú változása alapvetıen befolyásolja a növények növekedését, fejlıdését, terméshozamát és földrajzi elterjedését. Az alacsony hımérséklet káros hatásaival szembeni védekezés, azok kivédése, elkerülése ezért alapvetı fontosságú a növényi szervezet túlélése és terméshozama szempontjából. A globális klímaváltozás hatására kimutathatóan gyakoribbá váltak világszerte a hımérsékleti fluktuációk, a hirtelen felmelegedést követı gyors lehőlések, ami különösen a mérsékelt égövben hátrányosan befolyásolhatja a növények megfelelı fagyállóságának kialakulását (Gu és mtsai., 2008). Ez a jelenség új kihívások elé állítja a fejlett országok mezıgazdaságát is, ezért a mővelésbe vont növényfajok különbözı fajtáinak fagyállóságát kialakító és szabályozó folyamatok mélyebb megismerése, valamint ezen információk gyakorlati hasznosítása fontos feladat.
Termesztett gabonanövényeink, így például a búza, az árpa, a kukorica és a rizs a pázsitfőfélék (Poaceae) családjába tartoznak. A pázsitfőféléknek hatalmas ökológiai jelentıségük van. Bolygónk szárazföldi területeinek 30 %-át borítják füves puszták (préri, pampa, sztyeppe, füves szavanna), ahol a pázsitfőfélékhez tartozó növényfajok az uralkodók, de a trópusoktól a sarkkörökig, a tengerparti területektıl a magashegységekig elıforduló szinte valamennyi biomban megtalálhatók a fajaik. Fontos szerepet játszanak a csupasz földfelszín beerdısüléséhez vezetı folyamatban is, a szukcessziós sor korai, talajmegkötés szempontjából kulcsfontosságú társulásai általában füves társulások, valamint a nagytestő növényevı állatok és rágcsálók elsıdleges tápnövényei.
Az emberiség szempontjából szintén igen nagy jelentıséggel bírnak a pázsitfőfélék. A Föld népessége által betakarított növényi termények éves összmennyiségének 70 %-át, az emberiség éves kalóriafogyasztásának 50 %-át adják ezek a növények. Mintegy 300 fajt hasznosítanak világszerte, ebbıl 35 fajt domesztikáltak, nemesítenek is. Termesztésük 10 000 éves múltra tekint vissza, felhasználásuk nélkül nem jöhetett volna létre a neolitikus forradalom, melynek során a vadászó-győjtögetı életmódról a letelepedett, földmővelı életmódra való átállás mérföldkı volt a szociális és kulturális evolúciónk szempontjából is.
A növénycsoport sikerének titka egyrészt a családban kifejlıdött, számos elınyös evolúciós stratégiában rejlik. Ilyen a vegetatív szaporodási módok kiaknázása, például a tarackkal, gyöktörzzsel való gyors terjedés. Jellemzı rájuk a megtermékenyítési módok sokfélesége: általában szélbeporzásúak, de képesek az önbeporzásra, valamint elıfordul körükben az apomixis jelensége is, vagyis hogy a petesejtbıl megtermékenyítés nélkül fejlıdik ki az embrió, alakul ki a mag. Elterjedésüket segíti a hatékony magszórás és különféle magterjesztı készülékek fejlesztése, valamint a gyors egyedfejlıdési ciklus (a legtöbb pázsitfőféle egynyári növény). Könnyő, de teherbíró felépítésük szintén segíti túlélésüket. Ezt a nóduszos szerkezet és a fejlett szklerenchima teszi lehetıvé. Erre a legjobb példát a bambuszok jelentik, melyek bizonyos fajai DK-Ázsiában fa méretőre megnıve akár nagyobb ligeteket, erdıket is alkothatnak.
A pázsitfőfélék sikerének másik titka, hogy biokémiai, fiziológiai védekezési mechanizmusokkal hatékonyan tudnak fellépni a káros környezeti hatások ellen. A növények alapvetıen kétféle módon tudnak alkalmazkodni a környezeti kihívásokhoz. Az egyik mód az adaptáció, a génkészlet egyedekre ható szelekciós nyomás általi optimalizálása populációs
szinten, ami evolúciós idıskálán megszerzett, elınyös tulajdonságkombinációk kialakulását, elterjedését jelenti. Trópusi területeken honos pázsitfőféléknél például a fotoszintetikus mőködés környezeti feltételekhez történı hangolásának hatékony módszere a C4-es fotoszintetikus út, valamint az ahhoz szükséges szöveti felépítés (Kranz anatómia) kialakítása.
Lényeges adaptációs jelenség az is, hogy a gabonafélék hajtáscsúcsi merisztémája, ami a földfelszín feletti, többek között a fotoszintézis fontos feladatát végzı vegetatív, valamint a generatív növényi részek létrehozásáért felelıs, vegetatív állapotban a gyökérnyaknál, a földfelszín alá rejtve található, így védelmet élvez a tőz, az elfagyás és a növényevı állatok kártételével szemben.
A másik alapvetı módszer, amivel a növények felvehetik a harcot a káros környezeti hatások ellen az egyedi alkalmazkodás. Ha egy konkrét környezeti tényezıhöz (pl. alacsony hımérséklet) történı alkalmazkodásról beszélünk, ezt a jelenséget akklimációnak, ha komplex környezeti hatásokhoz (szimultán fellépı, szuboptimális körülményekhez - pl. aszálykor megjelenı betegségekhez, vízhiányhoz és hıstresszhez) együttesen történı alkalmazkodásról beszélünk, akkor akklimatizációnak hívjuk. A télállóság tehát akklimatizáció eredménye: azt a tulajdonsághalmazt értjük alatta, melynek segítségével a növények képesek túlélni a téli, kedvezıtlen idıszak káros hatásait (jégképzıdés, elfagyás, oxigénhiány, vízhiány, betegségek). Ennek egyik komponense a fagyállóság, ami a hidegakklimáció következménye, és a növény fagypont alatti hımérsékleten való túlélését biztosítja. Természetesen ez is komplex genetikai, biokémai, fiziológiai változások összességét jelenti, hiszen magának az alacsony hımérsékletnek is számos, különbözı biológiai szinteken jelentkezı hatása van. Az akklimáció során a növények a genetikai állományuk által lehetıvé tett kereteken belül változtatják meg úgy az anyagcseréjüket, hogy az - például védıanyagok termelésével - segítse ıket a védekezésben. Ez alapvetıen sejt szintő alkalmazkodást jelent. A másik, egyed szintő alkalmazkodási módszer, hogy szisztémás jelek hatására a növény az egyedfejlıdését, szaporodási ciklusát igazítja úgy, hogy a lehetı legellenállóbb életszakaszban vészelhesse át a kedvezıtlen idıszakot. Ennek érdekében például egyes növények csak meghatározott idıtartamú hideghatást követıen virágoznak (ezt nevezik vernalizációs igénynek). A növények a vernalizáció következtében, a generatív állapotba történı átmenetet követıen azonban elveszítik korábban megszerzett fagyállóságukat (Fowler és mtsai., 1996a; Fowler és Limin, 2004; Limin és Fowler, 2006). Ez alapján, valamint annak a ténynek az ismeretében, hogy mind a vernalizáció, mind a hidegakklimáció adott idıtartamú hideg periódus hatására következik be, feltételezhetı, hogy a két rendszer között kölcsönös regulációs kapcsolat van, ám ennek a kapcsolatnak a részletei még nem ismertek teljesen.
Kérdésfeltevés és célkitőzések
A különbözı biokémiai, fiziológiai mőködések hatékonyságának optimalizálása, valamint azok idızítésének és intenzitásának környezeti feltételekhez történı igazítása érdekében a növények tehát összehangolják a különbözı környezeti jelekre, valamint az ugyanarra a külsı stimulusra adott, de különbözı célú válaszaikat. Mivel ezt az összetett folyamatot egy bonyolult kölcsönhatásokból felépülı szabályozó rendszer irányítja, annak mőködését a jelenleg rendelkezésünkre álló eszközökkel, módszerekkel csak részleteiben tudjuk szakszerően vizsgálni, s a teljes folyamatra csak a részeredmények alapján kialakított elméleti modellek engednek rálátást. Az ilyen típusú kutatómunka során viszont nagyon lényeges, hogy több aspektusból is tanulmányozzuk a jelenséget. Munkánk során a meglévı ismereteink ellenırzése, kiegészítése céljából két különbözı megközelítésbıl vizsgáltuk a hideg által indukált, fagytőrést és vernalizációt szabályozó folyamatok molekuláris hátterét.
Gabonafélék vernalizációs és hidegakklimációs rendszerének mőködésével kapcsolatban viszonylag széleskörő a tudásunk, azonban e két, hideghatáshoz köthetı, ám különbözı eredıjő folyamat kapcsolatáról, a bennük szerepet játszó szabályozó faktorok közti kölcsönhatásokról már kevesebb információ áll rendelkezésünkre. Célunk tehát az volt, hogy speciális genetikai anyagon végzett vizsgálatokkal teszteljük a gabonafélék hidegstresszre adott molekuláris válaszreakcióiról kialakított modellek, hipotézisek helyességét, valamint kiegészítsük a hidegakklimációs és vernalizációs folyamatok szabályozásában szerepet játszó transzkripciós faktorok közti kölcsönhatásokról meglévı tudásunkat. Ennek érdekében tesztkísérleteknek vetettük alá az alakor (Triticum monococcum L.) MVP2 vonalat (mvp – maintained vegetative phase: fenntartott vegetatív állapotú mutáns), ami a VRN1 merisztéma identifikációs faktor génjét érintı deléciót tartalmaz. A kísérleti alany kiválasztását az indokolta, hogy a Triticum nemzetségbe tartozó, diploid kromoszómakészlető alakor (Triticum monococcum, L.; 2n=2x=14; genom: AmAm) és a nagy gazdasági jelentıségő, de bonyolultabb genomfelépítéső, allohexaploid kenyérbúza (Triticum aestivum, L.; 2n=6x=42;
genom: AABBDD) A kromoszómaszerelvénye, mely a fagyállóságot befolyásoló legfontosabb szabályozó géneket hordozza, ugyanattól a diploid ıstıl származik. Az alakor növények vizsgálata során kapott eredményekbıl tehát kenyérbúzára vonatkoztatva is fontos következtetéseket vonhatunk le a fagytőrés kialakulásának szabályozásában szerepet játszó molekuláris genetikai folyamatokról. A kísérletek során azt vizsgálatuk, hogy a VRN1 vernalizációs gén aktivitásának kiesése milyen hatással van a hidegakklimációs folyamatok szabályozásában kulcsszerepet játszó CBF-COR rendszer mőködésére, valamint hogy a vernalizációs gént érintı mutáció hogyan befolyásolja a hideghatáshoz köthetı (vernalizációs és akklimációs folyamatokkal kapcsolatos) fenotípusos változásokat. Ennek érdekében a következı feladatok elvégzését tőztük ki célul:
• Genotipizálás segítségével MVP2 mutáns vonal szegregáló populációjából származó növények közül a mutációt homozigóta recesszív formában hordozó (mvp/mvp) egyedek elkülönítése a vad allélt legalább egy kópiában hordozó (Mvp/-) egyedektıl.
• A genotipizálás alapján kialakított csoportokban a hajtáscsúcs fejlettségi állapotának meghatározása, valamint a VRN1 gén aktivitásának ellenırzése az elınevelés, illetve az edzés során.
• A két csoportban az FR-2 lókuszhoz kapcsolható CBF gének, valamint a COR14b gén hidegindukált aktivációjának, illetve utóbbi, késıbb indukálódó effektor gén esetében annak idıbeli változásának vizsgálata.
• Fagytesztek kivitelezésével az akklimációs folyamatok következtében kialakuló fagyállóság mértékének meghatározása a különbözı genetikai hátterő csoportokban.
• A növények általános fiziológiai állapotát érintı, hideg hatására bekövetkezı membránkárosodások következményeinek monitorozása az elınevelés, az edzés, valamint a fagyteszt során a levelek ionkiáramlásának, valamint a fotoszintetikus elektrontranszportlánc mőködési hatékonyságának mérésével.
A hidegindukált jelátviteli folyamatokkal kapcsolatos tudásunk hiányosságai miatt viszonylag kevés információ áll rendelkezésünkre azzal kapcsolatban is, hogy gabonafélékben a hidegstressz hatására meginduló akklimációs folyamatok szabályozásának mik az általános, tisztán hideghatáshoz köthetı molekuláris alapjai. Különösen fontos ez a kérdés a növény fagyállóságának legfontosabb komponensét, a regenerációs képességet meghatározó, elsısorban a hajtáscsúcsban elhelyezkedı, differenciálatlan osztódó szövetek esetében. Annak érdekében, hogy hozzájárulhassunk e terület felderítéséhez, a hidegakklimációval foglalkozó kutatások során általánosan használt intakt növényi rendszerektıl eltérı, speciális kísérleti
objektumon, a szisztémás és fényindukált jelátviteli kölcsönhatások kizárásával vizsgáltuk a CBF-COR rendszer alapvetı mőködési sajátosságait. Ehhez fagytőrı ıszi árpa (Hordeum vulgare L. cv. Nure; 2n=2x=14; genom: HH) embriogén kallusz kultúrák dedifferenciált, totipotens merisztemoid sejtjeinek tenyészeteit használtuk fel. A kísérleti alany kiválasztását egyrészt annak diploid genomfelépítése indokolta, ami egyszerőbbé teszi a vizsgált folyamatok genetikai hátterének felderítését. Emiatt az árpát - mint a Triticeae nemzetségcsoportba tartozó, termesztett gabonafélék közül a kenyérbúza legközelebbi rokonát – a távolabbi rokon Brachypodium distachyon helyett gyakran használják a gabonafélék modellnövényeként molekuláris genetikai vizsgálatoknál. Használatát az is indokolta, hogy szövettenyészeti rendszerekben jól fenntartható, könnyen kezelhetı faj.
Munkánk során a transzkripciós faktor gének expressziós profiljának meghatározása mellett célunk volt a hidegakklimáció fenotípusos változásokban megnyilvánuló jeleinek vizsgálata is: az esetlegesen kialakuló fagyállóság mértékének, valamint az akklimáció folyamatát befolyásoló, illetve azt indikáló endogén hormonok koncentrációjában bekövetkezı változások meghatározása. Ennek érdekében a következı feladatok elvégzését tőztük ki célul:
• İszi árpa dedifferenciált kallusz tenyészetébıl kialakított merisztemoid kultúrák szövettenyésztési rendszerének kidolgozása.
• Az elıkísérletek alapján kiválaszott CBF gének és a COR14b effektor gén expressziós profiljának felvétele hidegedzés során; az expressziós kinetika összehasonlítása intakt növényi és dedifferenciált szövettenyészeti rendszerekben.
• Rövidebb és hosszabb ideig tartó hidegkezelés hatásának vizsgálata a fent meghatározott mintázatra a szövettenyésztés során használt, szintetikus auxinanalóg alkalmazásának függvényében.
• Fagytesztek beállítása; a speciális objektum egyes fagytőrési komponenseinek (sejtes életképesség, tömegnövekedési ráta) méréséhez kellı módszertani beállítások elvégzése.
A tenyészetek hidegakklimáció hatására kialakuló fagytőrésének meghatározása a szövettenyésztés során használt, szintetikus auxinanalóg alkalmazásának függvényében.
• A tenyészetekben található endogén auxin, annak legfontosabb származékai, valamint a hideghatásra adott válaszreakciók kialakításában szerepet játszó stresszhormonok edzés hatására bekövetkezı koncentrációváltozásának vizsgálata a szövettenyésztés során használt, szintetikus auxinanalóg alkalmazásának függvényében.