ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK - Hideg által indukált, fagytőrést és vernalizációt szabályozó folyamatok

A VRN1 vernalizációs gén és a CBF-COR rendszer kölcsönhatásának vizsgálata deléciós mutáns alakor vonalban

A növénynevelés és az edzés körülményei

A kísérletben alakor (Triticum monococcum L.) MVP-2 mutáns vonalat vizsgáltunk. Ennek a vonalnak az eredeti, intakt vonallal történı visszakeresztezésébıl származó, a mutációt heterozigóta formában tartalmazó egyedeinek önbeporzásával létrehozott populációjának, valamint fagytőrı ıszi (G3116) és fagyérzékeny tavaszi (DV92) genotípusok (fagytesztnél használt kontroll vonalak) szemterméseit két napon keresztül csíráztattuk szobahımérsékleten, fényen, desztillált vízzel nedvesített, kétrétegő szőrıpapíron, Petri csészében. Ezután a csíranövényeket faládákba ültettük (a láda méretei: 42 x 30 x 14 cm; 9 cm vastagságban kerti föld és homok 3:1 arányú keverékével töltve), és 2 cm-es vastagságban talajkeverékkel takartuk. Mindegyik ládába 5-5 növény került a G3116 és DV92 vonalakból, valamint 35 növény kapott helyet az MVP-2 populációból (összesen 105 ilyen növényt ültettünk el). A növényeket fitotroni klímakamrában (Conviron, Kanada), kontroll körülmények között (nappalhossz: 16/8 (nappal/éj), hımérséklet: 20/20 °C (nappal/éj), relatív páratartalom: 75 %, megvilágítás intenzitása: 260 µmol/m²/s, naponta öntözés), 35 napon keresztül elıneveltük.

Az elınevelést követıen fokozatosan csökkentettük a hımérsékletet 4/4 °C-ra (nappal/éj). A növények lehőtését 4 napon át, naponta 4 °C-os hımérséklet-csökkentéssel végeztük, majd változatlan megvilágítás és vízellátás mellett 18 napig ezen a hımérsékleten hidegedzettük a növényeket.

A méréseket és vizsgálatokat a céltól és a módszertıl függıen az elınevelési idıszak (20/20 °C) végén (35 napos növényeken), valamint az elsıdleges edzési idıszak (4/4 °C) 8. és 32. órájában, 4. és 12. napján, illetve annak végén, a 18. napján, valamint a fagyteszteket követıen 16 órával, illetve a regenerációs periódus második napján, valamint második hetében végeztük. A teljes kísérletet kétszer megismételtük.

4. Ábra Fitotroni klímakamrák (Martonvásár) (A), illetve a faládába ültetett, MVP2 alakor (Triticum monococcum L.) vonal szegregáló populációjából származó növények nevelıkamrában (B).

Genotipizálás

A vad Mvp allél domináns jellege miatt akár már egy kópiában is normál fenotípust alakít ki a növényben (heterozigóta (Mvp/mvp) vagy homozigóta domináns (Mvp/Mvp) genetikai háttér).

Az mvp mutáció fenotípusos hatását tehát csak homozigóta recesszív elıfordulás esetén (mvp/mvp genetikai háttér) tudjuk vizsgálni. Azonban a mutáció ilyen formában sterilitást, a virágzás, kalászolás elmaradását eredményezi, így a mutációt hordozó növények az intakt vonallal történı visszakeresztezésbıl származó, heterozigóta egyedek önbeporzásával létrehozott, szegregáló F2 populációkban tarthatók fenn. Fiatalabb, fejlıdı növényben a genotípusos különbségek azonban még nem járnak az idısebb növényekre jellemzı, szemmel is látható fenotípusos különbségekkel (ilyenek mutáns egyedeknél a kalászolás hiánya, az intenzívebb bokrosodás, az alacsonyabb termet és a szétterülıbb szár). Ezért szükség volt a kísérleti növényi anyag egyedenként történı genotipizálására, a mutációra nézve homozigóta recesszív (mvp/mvp) genetikai hátterő, illetve a vad allélt egy vagy két kópiában hordozó (Mvp/-) egyedek molekuláris genetikai módszerrel történı elkülönítésére. Utóbbi csoport adatait a kísérlet során a vad kontroll eredményeként értékeltük. A feladatot domináns VRN1 molekuláris marker használatával, PCR technikával oldottuk meg, amihez három oligonukleotid primert használtunk (szekvenciáik az 1. Táblázatban szerepelnek). Mivel a deléció pontos határai nem voltak ismertek, így két PCR reakciót terveztünk. Az egyikben az MVP_F-18 és az MVP_R-22 primer segítségével egy 172 bp mérető terméket szaporítottunk fel mindkét csoport növényeibıl (ez amplifikációs kontrollként, a DNS integritásának ellenırzésére szolgált a target régióban). A másik reakcióban az MVP_F-18 és az MVP_R-23 primerek segítségével a deléció által érintett DNS szakasz egy részét is tartalmazó, 340 bp mérető terméket szaporítottunk fel vad növényekben, ami a homozigóta recesszív mutánsokban a deléció miatt hiányzott. Utóbbi növények esetében tehát csak egyetlen, míg vad növényeknél kettı, különbözı mérető PCR terméket kaptunk. (PCR körülmények: 20 µl reakciótérfogat, primerkoncentráció: 500 pM (MVP_R-22, MVP_R-23), 750 pM (MVP_F-18), 2,5 µM dNTP, 25 mM MgCl₂, 2,5 µl GoTaq puffer, 0,1 µl GoTaq (Promega, 5 U/µl);

PCR profil: 94 °C 2 min, [94 °C 20 sec, 60 °C 20 sec, 72 °C 15 sec], ciklusszám: 40).

A növényekbıl kontroll körülmények között, a harmadik levél megjelenésekor vettünk mintát (kb. 30-50 mg tömegő levéldarabot) a mérések során nem használt, legidısebb (legalsó) levél szárhoz legközelebb esı szegmensébıl. A DNS izolálásához a folyékony nitrogénben lefagyasztott mintákat 700 µl, felmelegített DNS extrakciós pufferben (100 mM Tris-HCl (pH=7,5), 500 mM NaCl, 50 mM EDTA, 1,25 % SDS, 0,38 % Na₂S₂O₅) homogenizáltuk, majd fél órán át 60 °C-os vízfürdıben inkubáltuk. Ezt követıen kloroform és izoamil-alkohol 24:1 arányú, hőtött elegyébıl 700 µl-t adtunk az oldathoz, homogenizáltuk a keveréket, majd 11 000 rpm fordulatszámon 15 percig centrifugáltuk. A vizes fázist átvittük egy tiszta Eppendorf csıbe, majd 1 ml hőtött etil-alkoholt (96 %) adtunk hozzá, s újból homogenizáltuk. Ezt követıen 11 000 rpm fordulatszámon 15 percig centrifugáltuk a mintákat, majd a kiülepedett csapadékról eltávolítottuk az oldatot, s etil-alkohollal (70 %) kétszer átmostuk. A mosást követıen eltávolítottuk az alkohol maradékát a pelletrıl, majd légáramban, szobahımérsékleten megszárítottuk a csapadékot, s 100 µl steril MQ (MilliQ) vízben feloldottuk. Ezt az oldatot használtuk a PCR reakciók templát oldataként.

A hajtáscsúcs fejlettségi állapotának meghatározása

Mvp/- és mvp/mvp genetikai hátterő, intakt növények legfejlettebb hajtását használtuk fel a hajtáscsúcsi merisztéma állapotának meghatározásához. Mintavételenként 3-3 különálló

növényt használtunk fel mindkét csoportból. Sztereomikroszkóp (Zeiss) alatt, szike, rovartő és ékszerész csipesz segítségével bontottuk ki a hajtáscsúcsokat a levelek és levélprimordiumok közül, majd 5x optikai zoom mellett azonnal, még a gyors kiszáradás által okozott zsugorodás elıtt lefényképeztük. A mintavételt elvégeztük az elınevelési periódus, illetve az elsıdleges edzési periódus végén is.

A vegetatív állapotot a gyökérnyak síkjából csak kevéssé kiemelkedı, domború, fényes felszínő hajtáscsúcs jelzi, melyrıl kizárólag levélprimordiumok főzıdnek le. A vegetatív és a generatív fázis közötti átmeneti állapot felé haladva a hajtáscsúcs megnyúlik, az apikális vége hosszúkássá válik, majd a levélprimordiumok felett elkezdenek kidomborodni a késıbbi kalászkakezdeményeket kialakító virágprimordiumok, ami miatt jellegzetes, kettıs befőzıdés (double ridge - dr) figyelhetı meg a hajtáscsúcson.

Real-time génexpressziós vizsgálatok (qRT-PCR)

A VRN1 gén expressziós aktivitását mintavételenként 3-3 homozigóta recesszív mutáns (mvp/mvp) és vad (Mvp/-) növény legfiatalabb, de már kifejlett levelébıl vett mintán ellenıriztük A mintavételt ugyanabban a napszakban, idıpontban, a kontroll körülmények között végzett elınevelés, illetve a hidegedzés legvégén végeztük.

A CBF gének (CBF2, -3, -4, -9, -10, -12, -13, -14, -15, -16 és -17), valamint az endogén kontrollként használt β-AKTIN gén expressziós aktivitásának meghatározásához mintavételenként 8-8 homozigóta recesszív mutáns (mvp/mvp) és vad (Mvp/-) növény legfiatalabb, de már kifejlett levelébıl vettünk mintát. A mintavételt ugyanabban a napszakban, idıpontban, a kontroll körülmények között végzett elınevelés legvégén, illetve egy nappal késıbb, 8 órás hidegedzést követıen végeztük.

A leveleket feltártuk, és RNS-t izoláltunk belılük Spectrum Plant Total RNA Kit (Sigma-Aldrich Kft.) használatával a gyártó instrukcióit követve, melynek 1 µg-ját templátként felhasználva cDNS-t írtunk QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen) segítségével, szintén gyártói instrukciók alapján. Minden egyes mintára független reakciót állítottunk össze. Ez a cDNS szolgált templátként a PCR reakciók real-time detektálásához, melyhez a reakcióelegyet SYBR Green reagens (Agilent) használatával állítottuk össze. A génekre tervezett primerpárok szekvenciái az 1. Táblázatban találhatók. A primerpárok mőködési hatékonyságát hígítási görbe módszerrel és agaróz gélelektroforézissel ellenıriztük a kísérleteket megelızıen. A mérést ABI Prism 7000 SDS készüléken kiviteleztük. Endogén kontrollként minden mintában meghatároztuk a β-AKTIN gén expressziós aktivitását is.

Mindegyik minta eredményét ugyanannak a kontroll körülmények között nevelt kalibrátor mintapopulációnak az eredményéhez viszonyítottuk Livak és Schmittgen (2001) 2^-∆∆Ct módszere alapján. A felszaporított termékeket az olvadási görbéjük analízisével is ellenıriztük a mérést követıen. Az egyes gének expressziójának mértékét a különbözı genetikai hátterő csoportokban a hidegedzést követıen egyutas ANOVA módszerrel hasonlítottuk össze (* p<0,05; ** p<0,01).

A COR14b gén hosszabb hidegedzés közben kirajzolódó expressziós profilját hasonló módon határoztuk meg, ám itt az elsı két mintavétel (elınevelés végén, illetve egy nappal késıbb, 8 órás hidegedzést követıen végzett mintagyőjtés) után tovább folytattuk az edzést, s a hidegkezelés 32. órájában, valamint 4. és 12. napján is vettünk mintákat (mindig ugyanabban a napszakban, idıpontban).

Fagyteszt

Az elsıdleges edzés végén a hımérsékletet tovább csökkentettük a másodlagos edzıdés kiváltásához. Ehhez 2 °C/óra sebességgel -2 °C-ra vittük le a hımérsékletet, majd 6 órán keresztül ezen a hımérsékleten tartottuk a növényeket. Ezt követıen visszaemeltük +2 °C-ra további 6 órára, majd újból lecsökkentettük -2 °C-ra, ahol 17 órán keresztül tartottuk a növényeket, majd tovább csökkentettük a hımérsékletet -4 °C-ra, ahol 22 órán keresztül tartózkodott a kísérleti anyag. A jégképzıdés beindításának érdekében -4 °C-ot elérve a növények levelét vízzel, egyenletes mértékben lepermeteztük. Ezt követıen a hımérsékletet 1

°C/óra sebességgel csökkentettük tovább a fagyasztási hımérsékletre, ahol 24 órán keresztül tartottuk a növényeket. Három különbözı fagytesztet végeztünk, -9, -12 és -13 °C-os fagyasztási hımérsékleten (ezeket az értékeket az elıkísérleteink alapján határoztuk meg). A másodlagos edzést és a fagyasztást fagyasztókamrában, sötétben végeztük.

A fagyasztást követıen a hımérsékletet fokozatosan (2 °C/óra) emeltük 12 °C-ra, majd a ládákat áthelyeztük a regenerációs kamrába. A regenerációs kamra beállításai a következık voltak: nappalhossz: 14/10 óra (nappal/éj), hımérséklet: 17/16 °C (nappal/éj), 75

% RH, a megvilágítás intenzitása: 260 µmol/m²/s, naponta öntözés. A regenerációs periódus második napján a hajtást és a leveleket a legidısebb (legalsó) levéllemez alapjának helyzetétıl számítva 1 cm-rel magasabban visszavágtuk, majd két hét regenerációs szakaszt követıen bonitálási érték (0-5) adásával, egyedenként értékeltük a regeneráció mértékét, valamint meghatároztuk a túlélési rátát. A bonitálási értéket szubjektív szempontok alapján, de a kísérleten belül konzekvensen adtuk a növényeknek. Az értékek megfelelıi a növény állapotát tekintve: 0 = teljesen kipusztult, megbarnult, kiszáradt növény, 1 = erıteljesen károsodott, regenerációt nem mutató, de nem teljesen elhalt növény, 2 = jelentısen károsodott, csekély mértékő regenerációt mutató, de ép szövetfoltokat is tartalmazó növény, 3

= közepesen károsodott, közepes mértékő regenerációt mutató növény, 4 = kevéssé károsodott, nagyobb mértékő regenerációt mutató növény, 5 = károsodást nem szenvedett, nagy mértékő regenerációt mutató, egészséges növény. A túlélési ráta meghatározásakor azokat a növényeket tekintettük túlélıknek, amelyek mutattak (akár csekély mértékő) regenerációt (2-es, 3-as, 4-es vagy 5-ös bonitálási értéket kapott egyedek), mert ez a kiszabaduló ionok megnövelték az oldat vezetıképességét, amit MultiSample konduktométer (Mikro KKt., Magyarország) segítségével mértünk meg. Az alapvonal megállapításához tiszta MQ vizet használtunk. A maximális ionkiáramlást úgy határoztuk meg, hogy ugyanazon

növény másik hajtásáról származó, ugyanolyan helyzető levélszegmenseket 20 percen át forrásban lévı MQ vízben fıztünk, majd a szobahımérsékletőre hőtött oldat vezetıképességét lemértük, és ezt az értéket vettük 100 %-os ionkiáramlásnak. A minták relatív konduktanciáját a tiszta MQ víz értékével normalizálva, a maximális érték százalékában fejeztük ki.

A mintavételt és a mérést elvégeztük az elınevelési és edzési periódus végén, valamint a fagytesztet követıen 16 órával mindhárom fagyasztási hımérséklet alkalmazása után, amikor a levelek már teljesen felolvadtak, és elérték a regenerációs hımérsékletet.

Az indukált fluoreszcencia intenzitásának mérése (Fv/Fm paraméter meghatározása)

Az Fv/Fm paraméter kiszámításához meghatároztuk a rendszer által produkált maximális fluoreszcencia értékét (Fm), amit sötétadaptált növények fotoszintetikus elektrontranszport láncának nagy intenzitású (1000 µmol/m²/s), ún. szaturációs fénnyel történı telítésével, majd az indukált fluoreszcencia intenzitásának mérésével valósítottunk meg. Az alap fluoreszcencia értéket (F0) még ez elıtt a mérés elıtt, telítést nem okozó, alacsony intenzitású (<0,1 µmol/m²/s) fény rövid ideig tartó felvillantását követıen mértük. A kettı különbsége adja a változó fluoreszcencia (Fv) értékét, melynek Fm értékkel képzett hányadosa az Fv/Fm paramétert (Krause és Weis, 1991).

A mérést minden alkalommal homozigóta recesszív mutáns (mvp/mvp) és vad (Mvp/-) csoporthoz tartozó 25-25 növény legfejlettebb hajtásának legfiatalabb, de már kifejlett levelének középsı harmadának adaxiális oldalán végeztük PAM 2000 hordozható fluorométer (Walz, Effeltrich, Németország) segítségével. A mérés elıtt 45 perces sötétadaptációt alkalmaztunk. A mérést a fotoszintetikus aktivitás napszakos ingadozása miatt minden alkalommal ugyanabban az idıpontban, a megvilágítási ciklus elsı harmadában végeztük.

A mérést megismételtük az elınevelési és az edzési periódus végén, a fagytesztet követıen 16 órával mindhárom fagyasztási hımérséklet alkalmazása után, amikor a levelek már teljesen felolvadtak, és elérték a regenerációs hımérsékletet, valamint az utóbbi mérésnél kapott eredmények ellenırzése céljából két napos regenerációt követıen is. (Az ellenırzés minden esetben megerısítette a fagytesztet követıen kapott eredményeket.)

A CBF-COR rendszer mőködési sajátosságainak vizsgálata dedifferenciált árpa szövettenyészetekben

A kallusz indukció és szövettenyésztés

A kallusz tenyészetek létrehozásához ıszi árpa (Hordeum vulgare L. cv. Nure) érett szemtermésébıl steril körülmények között izolált embriókat az elsı, kallusz indukciós táptalajra helyeztünk. Az alap táptalaj (pH=5,8) vitaminokat is tartalmazó, gyárilag elıállított MS tápsókeverék (Duchefa) felhasználásával készült, ezen kívül a szövettenyésztési elıkísérleteink alapján tartalmazott 1 g/l kazein hidrolizátumot (Sigma), 40 g/l maltózt és 8 g/l agart szilárdítóanyagként. A kallusz indukciós táptalaj a felsoroltakon kívül 2,5 mg/l szintetikus auxin analógot, Dicambát (3,6-dikloro-2-metoxibenzoésav), valamint 0,5 mg/l szintetikus citokinin analógot, BAP-ot (6-benzil-aminopurin) is tartalmazott. A kallusz tenyészeteket három hetente friss táptalajra helyeztük. Öt passzálást követıen az aktívan növekedı, morzsalékos szerkezető, világos színő, egészséges telepeket kiválogattuk, majd a második, kalluszfenntartó táptalajra kerültek, ami 1 mg/l Dicambát tartalmazott, BAP-ot nem.

Ezen a táptalajon további öt passzálás idejére neveltük a tenyészeteket. Ezt követıen két csoportra osztottuk ıket: az egyik csoport maradt a Dicambát tartalmazó kalluszfenntartó táptalajon (Dic(+) kultúrák), a másik csoportot Dicamba-mentes alaptáptalajra helyeztük (Dic(-) kultúrák). A stabil, egészséges és homogén kultúrákat a 13. passzálást követıen használtuk fel a kísérletekhez. A tenyészeteket a nevelés ideje alatt szövettenyésztési kontroll körülmények között, klímaszobában, sötétben, állandó +24 °C-os hımérsékleten, 50 % relatív páratartalom mellett tartottuk. Az adott növényi anyag és a kísérleti céljaink szempontjából optimális táptalajösszetételeket, azok váltásának idejét, a kalluszelıállítási és fenntartási protokollt szövettenyésztési elıkísérleteink alapján, magunk állapítottuk meg.

A növénynevelés és az edzés körülményei

A növényi anyag elıállításához a kalluszindukciónál használt ıszi árpa genotípus érett, sterilizált szemterméseit szobahımérsékleten, fényen, desztillált vízzel nedvesített, kétrétegő szőrıpapíron, Petri csészében csíráztattuk. A magok minıségének ellenırzése céljából meghatároztuk a csírázási százalékot (94 %). Három nap nevelést követıen a csíranövényeket faládákba ültettük (a láda méretei: 42 x 30 x 14 cm; 9 cm vastagságban kerti föld és homok 3:1 arányú keverékével töltve). A növényeket fitotroni klímakamrában (Conviron, Kanada), kontroll körülmények között (nappalhossz: 16/8 (nappal/éj), hımérséklet: 20/15 °C (nappal/éj), relatív páratartalom: 75 %, megvilágítás intenzitása: 260 µmol/m²/s), rövid ideig elıneveltük. Egy nappal az ültetést követıen a növények felénél megkezdtük a 4 °C-on történı hidegedzést, a másik felüket kontroll körülmények között neveltük tovább. A kontroll és edzett növényekbıl mintákat vettünk az elınevelés végén, valamint 2, 4, 6, 12, 24 és 48 órával a hidegkezelés kezdetétıl számítva. A mintákat mindegyik idıpontban három biológiai ismétlésben győjtöttük, egy parallel minta 3 különálló csíranövény bokrosodási csomóját tartalmazta. A győjtött anyagot a további felhasználásig folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, és -80 °C-os hőtıszekrényben tároltuk.

5. Ábra Árpa (Hordeum vulgare L. cv. Nure) csíranövények tápoldaton nevelve (A), illetve kettes típusú, embriogén kallusz kultúra (B).

A kalluszon végzett kísérletek beállítása és a szövettenyészetek edzése

Mind a Dic(+), mind a Dic(-) kultúrákat további két alcsoportra osztottuk: kontroll és hidegkezelt tenyészetekre. A hidegkezelt kultúrákat mindkét csoportból 4 °C-os klímakamrába helyeztük (sötétben, 50 % relatív páratartalom mellett). Mindegyik alcsoportból 3-3 parallel mintát győjtöttünk a hidegkezelés megkezdése elıtt, valamint 2, 4, 6, 12, 24 és 48 órával az edzés megkezdését követıen. Ezeken kívül az edzés hosszabb távú hatásainak vizsgálatához 4 és 7 nappal az edzés megkezdését követıen is végeztünk mintavételt. A génexpresszió és a hormonösszetétel vizsgálatához használt mintákat elkülönítettük, azonnal lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, s a további felhasználásig -80

°C-os hőtıszekrényben tároltuk. A minták másik részét a fagytesztekhez használtuk fel.

Fagyteszt kivitelezése kallusz kultúrákon

A szövettenyésztéssel fenntartott kultúrák fagyállóságának meghatározásához rövidítenünk és módosítanunk kellett a növényeknél használt protokollt, új rendszert, kiértékelési módszereket kellett meghonosítanunk az anyag eddig vizsgált rendszerektıl eltérı tulajdonságai miatt. Ennek érdekében számos elıkísérletet végeztünk, az itt leírt folyamatot az ezekbıl kapott adatok, információk alapján, magunk alakítottuk ki.

A parallel mintánként külön porciózott kallusz kultúrákat rövid ideig tartó, óvatos homogenizálást követıen steril, kétrétegő, MQ vízzel nedvesített szőrıpapírba csomagoltunk, majd légmentesen lezárva mőanyag tasakokba helyeztük. A mintákat ezt követıen folyadékos fagyasztókészülékbe (Grant GP200-R4 termosztát) helyeztük, melyben folyamatosan áramoltatott etilén-glikol oldat (50 %) biztosította a gyors hıátadást és az egyenletes hımérsékletet, amit fokozatosan csökkentettünk a nevelési hımérsékletrıl +4 °C-ra, majd -4

°C-ra (0,266 °C/perc sebességgel). Egy órán át tartó, -4 °C-on történı fagyasztást követıen a mintákat eltávolítottuk a készülékbıl, majd hagytuk szobahımérsékleten, lassan felolvadni ıket. A teljesen felolvadt mintákat megfeleztük, egyik felüket a hosszú távú regenerációs kapacitás vizsgálatához steril körülmények között végzett tömegmérést követıen kalluszfenntartó táptalajra helyeztük, másik felükön sejtes életképességi teszteket végeztünk.

A teljes fagytesztet két, független ismétlésben elvégeztük, majd – mivel az adatok megerısítették egymást – azokat összevonva elemeztük.

Hosszú távú regenerációs teszt

A fagyteszt kivitelezését és steril körülmények között végzett tömegmérést követıen kezelési alcsoportonként 3-3 parallel mintát helyeztünk kalluszfenntartó táptalajra. Szövettenyésztési kontroll körülmények között, klímakamrában három hétig neveltük a tenyészeteket, majd megismételtük a tömegmérést. A regenerációs rátát a kiindulási tömeghez képest megfigyelhetı tömegnövekedésbıl számoltuk a kiindulási tömeg százalékaként, s ezt a megfelelı kezelési alcsoporthoz tartozó, de nem fagyasztott minták értékeinek százalékában fejeztük ki.

Sejtes életképességi vizsgálat (TTC teszt)

Towill és Mazur (1975) protokollját optimalizáltuk az általunk elıállított árpa kallusz kultúrákra. Körülbelül 200 mg, óvatosan homogenizált szövetet kétszer átmostunk 50 mM-os foszfát pufferben (pH=7,5), majd 2 ml 0,08 %-os, steril 2,3,5-trifeniltetrazólium-klorid (TTC) oldatot (50 mM foszfár pufferben (pH=7,5) készítve) adtunk a kultúrákhoz. A mintákat szobahımérsékleten körkörös rázóra helyeztük, és 12 órán keresztül, sötétben inkubáltuk. Ezt követıen a TTC oldatot maradéktalanul eltávolítottuk a mintákról, majd a kultúrákat újból átmostuk foszfát pufferben. 1,5 ml 96 %-os etil-alkoholt adtunk a sejtekhez, majd a mintákat újabb 12 órán keresztül inkubáltuk körkörös rázón, szobahımérsékleten, sötétben, hogy a képzıdı formazant az oldatba vigyük. A kivonást követıen a sejteket lecentrifugáltuk, tömegüket lemértük, s a felülúszó abszorbanciáját 485 nm-es hullámhosszon spektrofotométerben (Varian Cary100 Scan) lemértük. A sejtes életképesség mértékét az 1000 mg kallusz kultúrára vonatkoztatott abszorbanciaértékek alapján számoltuk ki a megfelelı kezelési alcsoporthoz tartozó, de nem fagyasztott minták értékeinek százalékában.

Real-time génexpressziós vizsgálatok (qRT-PCR)

A begyőjtött mintákból teljes RNS kivonást végeztünk TRIzol reagenssel (Invitrogen), majd a mintákat tovább tisztítottuk RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) felhasználásával, a gyártó instrukciói alapján. A folyamatból származó RNS 1 µg-ját használtuk fel cDNS szintetizálásához M-MLV reverz transzkriptáz enzim (Promega) segítségével. Minden egyes mintára független reakciót állítottunk össze.

A PCR reakciót 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) készüléken monitoroztuk; a reakcióelegyet Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) felhasználásával állítottuk össze. A génekre tervezett primerpárok szekvenciái az 1.

Táblázatban találhatók. A primerpárok mőködési hatékonyságát hígítási görbe módszerrel és agaróz gélelektroforézissel ellenıriztük a kísérleteket megelızıen. A felszaporított termékeket az olvadási görbéjük analízisével is ellenıriztük a mérést követıen. Az eredmények ellenırzése céljából független mérések során megismételtük az analízist kísérleten belül random kiválasztott plate-ekre, valamint a teljes kísérletre nézve is. A gének expressziós aktivitását hidegedzés hatására β-AKTIN endogén kontroll gén expressziós szintjéhez viszonyítva, adott idıpontban győjtött, kontroll körülmények között nevelt minták értékéhez képest határoztuk meg Livak és Schmittgen (2001) 2^-∆∆Ct módszere alapján.

Fitohormonok és Dicamba mennyiségi meghatározása

A mintákban található exogén, mesterséges auxinanalógnak (Dicamba), az endogén auxinnak (indol-3-ecetsav (IAA)), az endogén auxinszármazékoknak (aszpartát (Asp), IAA-glükózészter (IAA-GE)), az abszcizinsavnak (ABA), az abszcizinsav katabolitjainak (fazeinsav (PA), neofazeinsav (Neo-PA), dihidro-fazeinsav (DPA)), a szalicilsavnak (SA) és a jazmonsavnak (JA) a koncentrációját határoztuk meg LC-MS-MS készülékkel. A minták feltárását és tisztítását reverz fázisú és ioncserélı kromatográfiás eljárással valósítottuk meg, Dobrev és Kaminek (2002) protokollja alapján. A hormonokat a folyamat végén metanolos oldatban nyertük ki. Ezt követıen a mintákat bepároltuk, majd 15 %-os, vizes acetonitril oldatban vettük fel ıket. A feltárás közben keletkezett veszteség mértékét izotóp higítási technikával mértük fel. Ehhez megfelelı stabilitású, izotóppal jelölt belsı standard molekulákat használtunk. A mennyiségi meghatározás a minták beinjektálását követıen HPLC készülékkel (Ultimate 3000, Dionex, Sunnyvale, USA) összekapcsolt, hibrid hármas kvadrupól és lineáris ioncsapdás analizátorú LC-MS/MS tömegspektrometriás rendszerben (3200 Q TRAP, Applied Biosystems, Foster City, USA) történt. A mérések együttmőködı partnerünk, Radomira Vankova vezetésével történtek a Cseh Köztársaság Tudományos

In document Hideg által indukált, fagytőrést és vernalizációt szabályozó folyamatok molekuláris hátterének vizsgálata gabonafélékben (Pldal 26-36)