Enantioszelektivitás vizsgálata szerves oldószerekben

A vizsgálatok során elsősorban az ionos folyadékokra és szuperkritikus CO2-os rendszerekre koncentráltam, de az enantioszelektivitás összehasonlításához a méréseket n-hexánban és etanolfeleslegben (egyéb oldószer felhasználása nélkül) is elvégeztem, tekintve, hogy a tejsav etanollal történő észterezése során a hozam vizsgálatára már történtek mérések szerves oldószeres közegben [Hasegawa, 2008; Inaba, 2009; Major, 2010], de az enantioszelektivitást még senki sem határozta meg. Bodnár [Bodnár, 1990] és Ulbert [Ulbert, 2004] a tejsavhoz hasonló molekulát, a 2-klór-propionsavat észterezték n-hexánban. Mindkettőjük esetében 70% körüli enantiomerfelesleget értek el. Az eredményeikből kiindulva ennél nagyobb enantiomerfelesleg értékeket a méréseim során sem várhattam, mivel a 2-klór-propionsavhoz képest a tejsav oldódása rosszabb. Ennek ellenére alacsony értékek mellett jobban összehasonlíthatók a paraméterek hatásai.

3.2.1. n-Hexán

Ebben az alfejezetben az n-hexánban folytatott mérési eredményeket mutatom be. A 4.

táblázatban részletezett beállítások mellett 0,14 g (22,7 mmol) hexánt alkalmaztam oldószerként.

A 4. táblázat adataiból és a 15. ábra oszlopairól elsőként megállapítható, hogy a hozam egyik esetben sem haladta meg a 60%-ot, maximális értéke 55% volt, melyet a 6-os és a 9-es mérési pontok esetében mértem. Azonban n-hexán esetében ez korántsem mondható alacsony értéknek. Az említett pontoknál 70 °C-on zajlott a reakció 3-as alk/TS arány mellett.

Ugyanezen a hőmérsékleten 11-es alk/TS aránynál a hozam csaknem a felére csökkent, de az is jól látható, hogy az alacsonyabb hőmérséklet is erősen csökkenti az észterhozamot.

Elmondható tehát, hogy a magas hőmérséklet és a kisebb alk/TS arány volt pozitív befolyással a hozamra a vizsgált intervallumon. A magas hőmérsékleten nagyobb hozam ténye alátámasztja Inaba és társai [Inaba, 2009] mérési eredményeit, ám ők csak 50 °C-ig vizsgálták a hőmérséklet hatását. Hasegawa és munkatársai [Hasegawa, 2008] kimutatták, hogy hexános közegben a savmennyiség növekedésével tovább csökkent az amúgy is alacsony hozam (50 °C-on). Esetünkben ugyanígy igaz a tendencia, valamint a 14. ábra azt is bizonyítja, hogy a legnagyobb hatással az alk/TS arány és a hőmérséklet van a hozamra.

4. táblázat: n-Hexános közegben végzett 3 faktoros, 3 szintes kísérletek és a kiegészítő mérések beállításai és az ezekhez tartozó eredmények, CALB ezim jelenlétében

Minta száma 1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 k2

T (°C) 30 30 30 30 50 70 70 70 70 50 50

alk/TS arány 3 11 11 3 7 3 11 11 3 15 19

víztartalom (m/m%) 8 8 16 16 12 8 8 16 16 4 4

hozam (%)

1 h 1,8 2,0 0,7 2,1 2,2 10,8 3,9 4,0 12,2 2,5 7,3

3 h 4,8 3,4 1,5 4,7 7,6 29,5 11,2 11,2 30,6 4,4 15,1

5 h 7,4 4,8 2,1 6,7 9,1 44,9 17,9 17,8 42,3 5,6 20,3

24 h 26,6 12,0 9,5 25,9 38,5 55,3 25,3 24,0 55,5 17,4 41,0 e.e. (%)

1 h 2,4 32,7 6,0 0,2 1,7 0,2 4,2 1,9 0,3 28,3 30,3

3 h 0,7 28,5 3,6 0,1 1,3 0,1 1,5 0,5 0,1 24,9 27,8

5 h 0,1 25,5 2,3 0,1 1,1 0,1 0,8 0,2 0,1 21,9 26,3

24 h 0,10 11,9 1,1 0,0 0,1 0,1 0,4 0,1 0,0 0,3 20,0

14. ábra: Az n-hexánban végzett mérések paramétereinek hatása a hozamra, CALB ezim jelenlétében

Major és társai [Major, 2010] 40 °C-on vizsgálták a reakciót n-hexános közegben. A reakcióelegy 0,2 mmol/cm³ racém tejsavat, 1 mmol/cm³ etanolt és 250 mg enzimet tartalmazott tejsav mmol-onként, ahol a reakcióelegy 5 cm³ térfogatú volt, a kezdeti víztartalom pedig 4,5 m/m%. Méréseik során enzim alkalmazása nélkül nem játszódott le a reakció. Az említett mennyiségű Novozym 435 használata mellett 14%-os hozamot mértek monomer tejsavra vonatkoztatva. A reakciót 5-ös alk/TS aránnyal végezték, mely közel áll a 2-es mérési pont paramétereihez, ahol a hozam közel azonos a mért eredményükkel. Az enantioszelektivitást nem lehet összehasonlítani irodalmi adatokkal, mivel erre a reakcióra más szerző még nem végzett méréseket.

A 2. pont esetében mértem a legnagyobb enantioszelektivitást (e.e.1h=33%), mely a 24 órás reakcióidő végére 12%-ig csökkent. Az n-hexánban történt mérések egyértelműen mutatják, hogy alacsony hőmérséklet, alacsony víztartalom és nagy alk/TS arány szükséges az enantioszelektív reakció megvalósításához, de ebben az esetben a hozam csupán 12%-os volt.

Mivel a 2. pont esetében az enantioszelektivitás értéke kiugróan nagy volt a többi mérési ponthoz képest, ezért a kísérleti adatokat két kiegészítő méréssel pontosítottam. A két további mérés 15-ös (k1) és 19-es (k2) alk/TS arány mellett történt 4 m/m%-os kezdeti víztartalom mellett 50 °C-on. Az k1-es pont estében az enantiomerfelesleg értéke 28% volt az első órában, de csekély hozam (17%) mellett. A k2-es pont viszont jobb eredményeket mutatott, itt az enantiomerfelesleg értéke 30% volt az első órában és a mérés végén is 20%-os maradt 41%-os hozam mellett. Elmondható, hogy a nagy alk/TS arány a vizsgált tartományban

nemcsak a hozamot emeli kisebb hőmérsékleten, hanem az e.e. értékét is. Ahogy látható a víztartalom csökkentésének hatása a vizsgálatoknak ezen a szintjén nem érzékelhető a hozamra nézve, az enantioszelektivitást kismértékben növeli, pl. a 2, 3-as pontok esetében.(További kiegészítő adatok a Függelék 58-64. ábráin láthatók)

15. ábra: Az n-hexánban történt 3 faktoros, 3 szintes kísérleti terv és a kiegészítő mérési pontok eredményei, CALB ezim jelenlétében

3.2.2. Etanolfelesleg (oldószermentes)

Ebben a kísérletsorozatban nem használtam hozzáadott oldószert, csupán az alkohol feleslege jelentette a közeg médiumát. Az előző mérésekhez képest eltérő módon az alk/TS arányt nagyobbra állítottam. Az eddigi 3, 7 és 11-es alk/TS arányok helyett 7, 11 és 15-es arányt alkalmaztam, a többi paraméter értéke ugyanaz maradt (5. táblázat). Torres és társai [Torres, 2001] az oldószermentes közeg vizsgálatánál nem alkalmaztak további etanol mennyiséget, viszont Hasegawa és munkatársai [Hasegawa, 2008] a többi szerves oldószerben végzett kísérletükben alkalmazott etanol mennyiség kétszeresét adták az oldószermentes elegyhez, melynek következményeképp nagyobb észterhozamot mutattak ki, mint kisebb mennyiségű etanol esetében. Ez az oka annak, hogy az n-hexános kísérletekhez képest nagyobb mennyiségű etanollal vizsgáltam az oldószermentes közeg hatásait.

0 10 20 30 40 50 60 70 80

1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 k2

Hozam (%) Enantiomerfelesleg (%)

Minta

Hozam (%) 24 óra után

Enantiomerfelesleg (%) 1 óra után Enantiomerfelesleg (%) 24 óra után

5. táblázat: Az etanolfeleslegben végzett kísérleti terv és a kiegészítő mérések beállításai a kapott eredményekkel, CALB ezim jelenlétében

Minta száma 1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 k2

T (°C) 30 30 30 30 50 70 70 70 70 50 50

alk/TS arány 7 15 15 7 11 7 15 15 7 15 19

víztartalom (m/m%) 8 8 16 16 12 8 8 16 16 4 4

hozam (%)

1 h 1,3 3,5 0,9 0,9 1,8 7,5 4,3 2,4 5,5 4,3 2,8

3 h 2,7 4,7 1,4 2,1 4,9 18,1 9,8 6,9 16,3 8,0 4,7

5 h 4,0 6,7 2,2 3,2 7,0 27,0 14,3 11,1 25,8 11,2 6,2 24 h 15,5 12,9 6,4 11,2 37,5 81,2 42,9 40,1 73,6 37,8 13,7 e.e. (%)

1 h 5,2 40,5 16,5 1,6 4,1 0,8 5,6 2,7 0,4 19,5 30,1

3 h 2,6 37,5 10,8 1,2 1,4 0,3 2,6 0,9 0,3 12,7 28,1

5 h 2,1 35,8 7,0 0,7 0,8 0,1 1,7 0,7 0,2 9,4 26,8

24 h 0,3 22,2 1,9 0,4 0,2 0,0 1,0 0,0 0,1 2,9 18,6

16. ábra: Etanolfeleslegben végzett mérések paramétereinek hatása a hozamra, CALB ezim jelenlétében

Az 5. táblázatban és a 17. ábrán (valamint a Függelék 65-71. ábráin) bemutatott eredmények szerint a 2. pont paraméterkombinációjával értem el a legnagyobb enantiomerfelesleget 40%

értékben, viszont emellett a hozam csak 13%-os lett. Egyértelműen látszik, hogy a nagy hőmérséklet miként növeli a hozamot az enzim aktivitásának növelésével, ám ezzel együtt az enantioszelektivitás csökken. A 16. ábra megmutatja, hogy a legnagyobb hatást a hőmérséklet

játssza a reakció során. Az eredmények értékeléséből kiderül, hogy az enantiomerfeleslegnek inkább az alacsony hőmérséklet, a nagy alk/TS arány és a kis víztartalom kedvez, ahogy a 2.

pontban látható.

A nagy enantiomerfelesleg értéke miatt kiegészítő méréseket végeztem a hexános kísérlettel azonos módon. Ahogy az alk/TS arányt növeltem, a 3 faktoros, 3 szintes kísérleti terv 2-es pontjában bemutatott enantiomerfelesleg értéke csökkent, viszont a hozam növekedett. Erre a jelenségre igaz Bodnár és társainak [Bodnár, 1990] megfigyelése. Ahogy az alkohol feleslegét növelték, először növekedni kezdett a hozamot, majd csökkentette azt. Ez figyelhető meg a 6-7, 9-8, k1-k2 pontokat összehasonlítva. Magyarázata az volt, hogy a növekvő alkoholmennyiség megváltoztatja a folyadék és szilárd fázis közötti víz eloszlását. Az enzim vízburkának csökkenése miatt következik be a hozam csökkenése. Azt is leírta, hogy az enantioszelektivitást az alkohol mennyiségének növelésével érte el a maximális értéket, mely a k1-k2 pontok esetében is megfigyelhető. Inaba [Inaba, 2009] megállapítása is érvényes, mivel a magasabb hőmérséklet itt is előnyösen befolyásolta az észterhozamot.

17. ábra: Etanolfeleslegben történt 3 faktoros, 3 szintes kísérleti terv és a kiegészítő mérési pontok eredményei, CALB ezim jelenlétében