Enantioszelektív reakciók

A sztereoszelektivitást az egyes enantiomerek előállítása során használják ki, mely egyre fontosabbá válik a gyógyszeriparban és az agrokémiai iparban. Főként azért van szükség az enantioszelektív módszerekre, mivel csak az egyik enantiomer rendelkezik a kívánt hatással, míg a másik hatástalan vagy nem kívánt mellékreakciókat okoz.

A sztereoszelektív reakciókban a leggyakrabban használt enzimek a lipázok. Ezek a reakciók olyan paraméterektől függhetnek, mint pl. az enantiotrópok és enantiomerek differenciálódása, a szubsztrátok típusa, a szubsztrát és az enzim biokémiai kölcsönhatása, a szubsztrátok sztérikus interakciója, két különböző szubsztrát versengése, a sztereoszelektív reakció aktív helyének természete és elérhetősége, víz jelenléte és az oldószerek természete [Fan, 2010].

A számos reakciókörülmény közül elengedhetetlen a reakcióközeg vizsgálata. Ezek lehetnek vizes közegek, szerves oldószerek, kétfázisú rendszerek, melyek nagyban befolyásolhatják az enantioszelektivitást. Számos kutató alkalmazza az oldószermérnökség tudományát [Rotticci, 2000]. Azt is bebizonyították, hogy a CALB és Pseudomonas cepacia enzimek enantioszelektivitása számos szekunder alkohol esetében lényegesen növelhető ionos folyadék jelenlétében [Bornscheuer, 2002].

A hőmérséklet bizonyítottan hatással van az enantioszelektivitásra, és a kinetikai rezolválás során a következő egyenlet érvényes [Rotticci, 2000]:

RT

R – egyetemes gázállandó (8,314 J/mol/K) T – hőmérséklet (°C)

H^# – standard entalpiaváltozás S^# – standard entrópiaváltozás

Az enantioszelektivitás csökkenhet vagy növekedhet is a hőmérséklet függvényében az entrópia és az entalpia hatásaként. A legtöbb reakcióban a hőmérséklet csökkenésével fordított arányosságban növekszik az enantioszelektivitás [Rotticci, 2000]. Persson és társai [Persson, 2002] a 2-fenil-propionsav 1-heptanollal történő észterezése során kimutatták, hogy

más vizsgált lipázokhoz képest (Rhizopus oryzae, Candida rugosa, Rhizomucor miehei) a CALB az (R)-enantiomert részesíti előnyben, valamint az E-érték a többi esethez képest növekedés helyett csökkent a hőmérséklet csökkenésével. Ez azt jelenti, hogy mind a 4 fajta vizsgált lipáz enzim esetében a hőmérséklet csökkenése az (S)-enantiomer felé tolta el az enantiomer arányt.

A szubsztrátok koncentrációja is nagyban befolyásolja az enantioszelektivitást, pl. lipázos észterezés esetében ez az egyensúlyi ponttól való távolság. Az enzim a termékképződés és a hidrolízis során is ugyanazt az enantiomert részesíti előnyben. Ha az egyensúlyi pontot a termékképzés irányába toljuk el, az a konverziót és az enantioszelektivitást is növeli. Ilyenkor viszont az alkohol inhibícióval kell számolni. Kisebb alkohol mennyiségek alkalmazásánál minden esetben nagyobb volt az enantioszelektivitás [Berglund, 2001].

Az oldószer víztartalma gyakran befolyásolja a reakciósebességet és az enantioszelektivitást is. A nagyszámú vizsgálat ellenére nem létezik általános szabály az enzim enantioszelektivitásának optimalizálásához. Ez valószínűleg a természetben előforduló számos enzimtípusnak köszönhető, de ugyanez elmondható enzimtípusokon belülre is [Rotticci, 2000]. Az enzim hidratáltsága nagyban meghatározza a protein rugalmasságát és ez által a katalitikus aktivitását. Az alacsony hidratáltság kevésbé rugalmas enzimhez vezet, mely általában kevésbé aktív. Néhány tanulmány szerint a rugalmas enzimnek kisebb lehetősége van a két enantiomer között választani. Ennek ellenére, ha a merevebb enzim kevésbé tudna idomulni a gyorsabban reagáló enantiomerhez, mint a lassúhoz, akkor alacsony hidratáltsági foknál elvesztené az enantioszelektivitását. Tanulmányok igazolják, hogy a növekvő víztartalom növeli az enantioszelektivitást [Kitaguchi, 1990], de néhány esetben csökken [Bodnár, 1990], vagy épp semmi hatása nincs a víz hozzáadásának [Bovara, 1993], de e kísérletek mindegyikét más típusú enzimmel és szubsztráttal végezték. Persson és társai [Persson, 2002] kísérleteket végeztek a víztartalom szerepének vizsgálatára, ahol 4 féle lipáz enzimet használtak a 2-fenil-propionsav heptanollal történő észterezésénél. Megállapították, hogy a lipázok többségének enantioszelektivitására nem volt hatással a víztartalom. Az egyetlen kivétel az egyik fajta Candida rugosa volt, mely esetében az enantioszelektivitás csökkent a vízaktivitás növekedésével. A vinil-butirát 1-butanollal történő észterezését vizsgálták Lozano és társai [Lozano, 2002] CALB enzimet felhasználva. Az enzim vizes oldatát [EMIM][NTf2] ionos folyadékban feloldották, a reakciót pedig különböző hőmérsékleteken scCO2-ban játszatták le. Kimutatták, hogy az alacsony víztartalomnak (<4 m/m%) köszönhetően nagy szelektivitás mutatkozott (>95%). Az enantioszelektivitást ezen

felül előnyösen befolyásolta még a hőmérséklet emelése. 40-ről 100 °C-ra emelve a reakció hőmérsékletét a szelektivitás 96%-ról 99%-ra emelkedett.

Végső soron megállapítható, hogy az előbb említett két paraméter hatásai nem egyértelműek, ezért az enantioszelektivitásra gyakorolt hatásukat nem tudjuk biztosan megjósolni.

Számos tanulmány foglalkozik az enzimes úton történő aszimmetrikus észterezési reakciókkal. Ilyen például a (±)-mentol enantioszelektív észterezése [Zhang, 2008], a (D,L)-fenilglicin-metil-észter hidrolízise [Lou, 2006], a racém ibuprofén észterezése [Ikeda, 2002].

Tejsav enzimatikus enantioszelektív észterezésével alig néhányan foglalkoztak, viszont a tejsavhoz hasonló, egy funkciós csoportban különböző molekula, a 2-klór-propionsav rezolválását vizsgálták Bodnár és munkatársai [Bodnár, 1990]. Ez a vegyület a herbicid gyártásban jelentős vegyület, de csak az (R)-enantiomer bizonyult hatásosnak. A reakciók során az oldószer-polaritás, a sav : alkohol mólarány, az alkohol szerkezet, a hőmérséklet és a reakcióelegy víztartalmának hatását vizsgálták Candida rugosa enzim használata esetén. A reakcióelegy 0,01 mol racém savat, 0,06 mol alkoholt és 50-100 cm³ vízmentes oldószert tartalmazott, melyhez 0-200 mg vizet adtak. Az oldószer vizsgálata során kiderült, hogy a legnagyobb, közel 80%-os konverziót az 1-butanollal való észterezés során n-hexán és metil-ciklohexán közegében érték el, 6 óra reakcióidő után. Az enantioszelektivitás kevéssé függött az oldószerektől, 42%-os konverziónál 62% és 74% közötti enantiomerfelesleg értékeket mértek. A víztartalom vizsgálatakor kimutatták, hogy a konverzió kisebb víztartalom esetén (0,25 m/m%) mutatta a maximumot. A termék enantiomer tisztasága 0,4 m/m% kezdeti víztartalom felett kezdett el csökkenni. Végeztek kísérleteket különböző szénlánc hosszúságú alkoholokkal, C₈-ig, de metanollal és etanollal nem játszódott le észterezés. Kimutatták, hogy a legnagyobb hozamot 1-butanollal lehet elérni. Enantioszelektivitás szempontjából szintén az 1-butanol esetében mérték a legnagyobb értékeket (e.e.=74%, y=42%), de az 1- és 2-propanol is közel 70%-os enantiomerfelesleg értékeket hozott. Vizsgálták továbbá a sav : alkohol mólarányt, ahol az értékeket 1 : 1 és 1 : 10 tartományban változtatták. Az alkohol kis feleslege a reakciót lassúvá tette, de a felesleg növelése a reakciósebességet is növelte, a maximumot pedig 1 : 6 aránynál érte el. Az arány további növelésével a hozam csökkenni kezdett, viszont az enantiomer tisztaság ekkor érte el a maximumát. Ennek magyarázata az lehet, hogy az alkoholfelesleg növelése megváltoztatja a víz eloszlását a folyadék és szilárd (enzim) fázis között, így a növekvő alkohol mennyiség a folyadék fázisban csökkenti az enzim vízburkát. A hőmérséklet vizsgálata során 20 és 50 °C közötti értékeken mozogtak. A hozam 30 °C-on volt a legnagyobb.

Ulbert és munkatársai [Ulbert, 2004] a 2-szubsztituált-propionsavat szelektíven észterezték butanollal Candida rugosa enzim segítségével. A reakcióközegek n-hexán és [BMIM]PF6

ionos folyadék voltak. Sikeres enantioszelektív észterezést hajtottak végre klór, bróm, metoxi, etoxi, propoxi, izopropoxi és fenoxi szubsztituens esetében. A legnagyobb hozamot a 2-klór-propionsavval érték el, és az enantioszelektivitás is ennél a savnál érte el a legnagyobb értékeket.