Enantioszelektivitás

A kinetikai rezolválás a IUPAC megfogalmazása szerint a következő: Ha egy reakció sebessége az egyik enantiomer esetében lényegesen eltérő a másik enantiomerétől, akkor az egyik sztereoizomer túlsúlyát kapjuk. A rezolválás az enantiomerek szétválasztását jelenti. A kinetikai rezolválás lehet részleges vagy teljes, mely a racém elegyben lévő enantiomerek egyenlőtlen reakciósebességéből adódóan valósítható meg. A két enantiomer eltérő reakciósebessége egy királis reakciópartnernek köszönhető, pl. katalizátor, oldószer, stb.

[Moss, 1996]. A kinetikai rezolválás legegyszerűbb esetében a szubsztrát enantiomerek egy királis reagenssel vagy katalizátorral lépnek reakcióba, mely során két diasztereomer átalakulás játszódik le. Ezen versengő átalakulási állapotok szabadentalpiája befolyásolja a lassan és gyorsan reagáló komponens sebességi állandóját, ahol a k_gyors/klassú határozza meg a termékek arányát.

A lipázokkal történő kinetikai rezolválást Dalkin [Dalkin, 1903] vizsgálta elsőként. Ő sertésmájból kivont lipázzal végezte a racém etil-mandalát hidrolízisét. Eredményei megmutatták, hogy az enzimek nem tökéletesen enantioszelektívek, ezért számításba kell venni a relatív reakciókészséget és a konverzió mértékét is.

A racém elegyekből enantiomer tiszta termék előállításához a hagyományos módszer a kinetikai rezolválás, ám ennek van egy lényeges korlátja. Még ideális esetben is meg kell

állítani a reakciót 50%-os konverziónál, mikor az összes reaktív enantiomer termékké alakult, vagyis mikor az enantiomer tiszta termék konverziója megtörtént. Sok esetben a konverzió még nem éri el az 50%-ot, de a reakciót mégis le kell állítani kisebb konverziónál, vagy amikor a két enantiomer reakciósebességének különbsége már nem elég nagy ahhoz, hogy megfelelő enantioszelektivitást biztosítson. Ezen felül az el nem reagált komponensek közül történő termékelválasztás is további problémákat vet fel. Az el nem reagált összetevők problémájára több megoldás is létezik: pl. prokirális szubsztrátok vagy mezo vegyületek használatával [Schoffers, 1996], a nemkívánt enantiomer sztereokémiájának megfordításával (sztereoinverzió) [Stecher, 1997], a visszamaradt szubsztrát racemizáció utáni visszaforgatásával vagy dinamikus kinetikai rezolválással. A legutóbbi eljárásban a nemkívánt enantiomereket in situ racemizálják, és folyamatosan termékké alakítják [Dijksman, 2002].

A kinetikai rezolválás és a dinamikus kinetikai rezolválás (2. ábra) esetében egyaránt a gyorsabban reagáló (R)-szubsztrát (R)-termékké alakul. Az egyetlen különbség a két eljárás között az, hogy hagyományos esetben a lassan reagáló (S)-szubsztrát visszamarad el nem reagált komponensként, míg dinamikus rezolválás esetében az (S)-szubsztrát folyamatosan racemizálódik, így az (R)- és (S)-szubsztrát ismét egyensúlyba kerül. Ez teszi lehetővé, hogy a minden kiindulási anyag (R)-termékké alakuljon [Dijksman, 2002].

2. ábra: A kinetikai és dinamikus kinetikai rezolválás folyamata [Dijksman, 2002].

Kazlauskas és társai [Kazlauskas, 1991] elmélete szerint minden lipáznak ugyanolyan affinitása van bizonyos szubsztrátokhoz, de más enantioszelektivitással. Ennek magyarázatára dolgozott ki egy modellt, melyben kifejti, hogy minden lipáz két különböző méretű „zsebbel” rendelkezik, egy nagy és egy kisméretűvel. A szubsztrátokra kifejtett enantioszelektivitás az alkoholok kisebb és nagyobb szubsztituenséből származik. A gyorsan reagáló enantiomer a 3. ábra bal oldalán mutatott aktív helyhez kapcsolódik. Ha a másik

enantiomer lép reakcióba a lipázzal, akkor arra van kényszerítve, hogy a nagyobb szubsztituenst illessze a kisebbik zsebbe (3. ábra jobb oldal). Ez alapján a szubsztituens és a zseb közötti sztérikus taszítás megrepeszti a katalitikus triádot, mellyel magyarázható az alacsonyabb reakciósebesség. A reakció irányától függetlenül, vagyis észterezés és hidrolízis esetén is az (R)-enantiomer reagál gyorsabban.

3. ábra: A gyorsan (bal) és lassan reagáló (jobb) enantiomerek kapcsolódása az enzim „zsebeihez”

[Kazlauskas, 1991].

Chen és munkatársai alkottak modellt és írták le kvantitatív módszerekkel az irreverzibilis [Chen, 1982] és reverzibilis [Chen, 1987] enantioszelektív reakciókat. Összekapcsolták a reakciók három kulcsparaméterét: a racém szubsztrát konverziójának mértékét (c); az optikai tisztaságot; melyet enantiomerfeleslegben fejezünk ki (ee) a termékre vagy a fennmaradó szubsztrátra nézve; és az enantiomer arányt (E).

Egy irreverzibilis reakció esetén A és B a gyorsan és a lassan reagáló enantiomerek, melyek az enzimnek ugyanazon helyéhez kapcsolódnak. Egy egyszerű háromlépéses kinetikus mechanizmushoz felírtak egy egyenletet, ahol a reakció irreverzibilis és nincs termékinhibíció:

(1)

(2)

(3) (4)

Q P

Q P P

ee( ) (5)

0 0

1 A B

B c A

ahol

kx: reakciósebességi állandó c: a konverzió mértéke

ee(P): a termék enantiomerfeleslege Va/Vb: reakciósebesség A/B enantiomerre Ka/Kb: A/B enantiomer egyensúlyi állandója A/B: A/B enantiomer koncentrációja

A0/B0: A/B enantiomer kezdeti koncentrációja P/Q: P/Q termék koncentrációja

Reverzibilis rendszereknél az enzimes rezolválás kinetikájában a következő figyelhető meg: a reakció kezdeti szakaszában az enzim kedvezően támadja a gyorsan reagáló (A) enantiomert és termékké (P) alakítja. A nagy enantiospecifikusság a két versengő reakció nagy nettó sebességkülönbségéből adódik. Ahogy a gyorsan reagáló komponens megközelíti az egyensúlyi állapotot, a nettó sebesség fokozatosan csökken, mialatt a lassan reagáló (B) enantiomer átalakulása is elkezdődik. Mikor a gyorsan reagáló komponens egyensúlya beáll (sebesség=0), a visszamaradt szubsztrát (eeS) és a képződött termék (eeP) optikai tisztasága elkezd esni a lassan reagáló komponens koncentrációjának növekedésének köszönhetően. A megfigyeléseket a következő egyenletekkel írták le:

(6)

(7) (8) (9)

Enantiomerek enzimes kinetikai rezolválása során, ha a két versengő reakció irreverzibilis, akkor a szubsztrát és termék optikai tisztasága a konverzió mértékétől (c) és az enantiomer aránytól (E) függ. Azonban reverzibilis biokatalitikus rendszereknél az eeS és eeP (a c-n és E-n kívül) a K egyeE-nsúlyi állaE-ndótól is függ. Végső soroE-n a visszamaradó szubsztrát E-nagy optikai tisztasága (eeS>=0,98) nem valósítható meg 50%-on túlmenő konverzióval. A 4. ábrán látható grafikus ábrázolások lehetővé teszik E és K érték meghatározása után, hogy precízen megbecsüljük, mikor állítsuk meg a kinetikus rezolválást ahhoz, hogy maximáljuk a kémiai és

Q B P K A

optikai hozamot. A rezolválás befejezésének optimális időpontját akkor érjük el, ha a gyorsan reagáló enantiomer eléri az egyensúlyt. Kézenfekvő, hogy magas enantiospecifikus észterezés végrehajtásához elengedhetetlen, hogy a víztartalmat a szerves közegben minimális értéken tartsuk, hogy elkerüljük a reverz hidrolitikus folyamatot [Chen, 1987].

A kinetikus rezolválás során keletkezett termékek (P>Q) hidrolizálhatók, mellyel visszanyerjük a kiindulási A és B komponenst. A kinyert frakció optikai tisztasága további reakcióban növelhető az első reakcióban használt reakciókörülmények mellett. A visszaforgatásos kísérletekben az ee0 (a kiindulási komponensekre vonatkoztatott enantiomerfelesleg) értéke nagyobb 0-nál.

4. ábra: Enantiomerfelesleg a konverzió függévényében különböző E és K értékeknél (E: 1 (1000, 2 (100), 3 (10), K: a (0), b (0,1), c (0,5), d (1), e (5)) [Chen, 1987].

Az enantioszelektivitás mérésére különböző módszereket használnak. A leggyakoribb technika egy racém szubsztrát elegy reakciójának vizsgálata, ahol a reakció hozamát és a szubsztrát vagy termék enantiomerfeleslegét mérik meghatározott reakcióidő után [Chen, 1982; Chen, 1987]. Az E érték feltételezhetően konstans a reakció lefutása alatt, de vannak utalások arra, hogy ez nem mindig igaz. Ennek a viselkedésnek a fő oka a reakció reverzibilitása, mely az idővel csökkenti az enantioszelektivitást. Egy másik módszer az

enantioszelektivitás meghatározására a két enantiomer specificitási konstansa arányának számolása két különálló reakcióban [Wehtje, 1997]. A harmadik módszer szerint az enzim aktivitásának mérésére különböző enantiomer arányú szubsztrátokkal lehetséges [Högberg, 1993]. A két utóbbi technika az egyik enantiomer tiszta formáját igényli.