Reichardt’s dye

(1)

1

OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA 2008

1.1. Festékpróbák az anyagtudományban (KM) 1.2. Fluoreszcencia-mikroszkópia (VT)

1.3. Fotodinamikus terápia (VT)

1.4. Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia (PK) 1.5. Fotokróm anyagok (BP)

1.6. Optikai érzékelők (KM)

(2)

Joseph Fraunhofer kísérlete 1815

A Nap fényét optikai rácson felbontotta.

A folytonos színképben fekete vonalakat észlelt.

(3)

3

A nap színképe

(4)

Erwin Schrödinger: Quantisierung als Eigenwertproblem (1926)

(5)

5

F é n y f o r r á s R é s e k

F o t ó d i ó d a t ö m b

M i n t a

h o l o g r a f i k u s r á c s H o m o r ú

EGYSUGARAS UV-LÁTHATÓ ABSZORPCIÓS SPEKTROMÉTER

(6)

Festékpróbák

A mikrokörnyezetről adnak információt, például egy sejten belül. A mért paraméter pl. polaritás, viszkozitás, hőmérséklet, diffúzió-sebesség.

(7)

7

Reichardt’s dye

N Ph Ph

Ph

Ph Ph

O +

_

Abszorbeáló próba – polaritás mérése

(8)

N Ph Ph

Ph

Ph Ph

O +

_ O

Ph Ph

Ph

N Ph

. .

h

Reichardt’s dye

(9)

9

S₀

 = 810 nm Ph-O-Ph

 = 453 nm H₂O

S₁

Oldószer polaritás

(10)

skála

Az oldószer polaritását jellemzi.

N

E

T

   

 

^víz ^E



^TMS



E

TMS E

oldószer E E

T T

T N T

T 

 

(11)

11

Szolvatokromizmus: a szín függ az oldószertől

(12)

Termokromizmus: A szín függ a hőmérséklettől

Etanolban + 78 C _max= 568 nm - 78 C _max= 513 nm

(13)

13

Termokromizmus: A szín függ a hőmérséklettől

Etanolban + 78 C _max= 568 nm - 78 C _max= 513 nm

Piezokromizmus: A szín függ a nyomástól Etanolban  1 bar _max= 547 nm

10 kbar _max= 520 nm

(14)

Abszorbeáló festékpróba CD-

spektroszkópiai alkalmazása

(15)

15

Példa biológiai CD vizsgálatra:

DNS vizsgálata akridin naranccsal

N

N N

H

+ AN

Az AN „interkalációs” komplexet képez

Indukált CD: nem királis festékmolekula királis környezetben CD jelet ad.

(16)

AN – DNS

rendszerek CD spektruma

A hozzáadott DNS konc.-ja változik

c

_A0

= 10

^-5

M

Ha kevés a DNS,

sok dimer, amit az

(17)

17

A fluoreszcenciamérés előnyei az abszorpcióméréssel szemben

1. Nem kell átlátszó minta 2. Nagyobb érzékenység

3. Háromszoros szelektivitás

- gerjesztési hullámhossz szerint - emissziós hullámhossz szerint - lecsengési idő szerint

Hátrány: a vegyületeknek csak kis hányada fluoreszkál

(18)

Fluoreszcens festékpróbák

(19)

19

O N

N N C2H5

C2H5 C2H5

C2H5 +

ClO 4-

Oxazin 1

(20)

0 0,5 1 1,5 2 2,5

200 400 600 800

Hullámhossz (nm)

Abszorbancia

Oxazin 1 UV-látható abszorpciós spektruma

(21)

21

Oxazin1 + receptor

(22)

(23)

23

Stacionárius fluoreszcencia módszerek

Kioltás

Oldószer-függés Hőmérsékletfüggés

(24)

(25)

25

Statikus kioltás

(26)

Oxazin1 + receptor

(27)

27

(28)

(29)

29

Dinamikus kioltás

(30)

(31)

31

(32)

M + h

M + 

M + Q M^*

Dinamikus kioltás

(33)

33

A dezaktiválódás sebessége és fluoreszcencia-hatásfoka

Kioltó nélkül

 

^ ^

 

^ ^

 

^

 k M k M

dt M d

nr f

Kioltóval

 

^k

 

^M ^k

   

^M ^k ^M

^{ }

^Q

dt M d

q nr

f



 







     

f nr f nr

f 0 f

k k

k M

k

M Φ k

 

 _  ^ _

 

^M ^k

   

^M ^k

^{ }

^Q ^k ^k ^k ^k

^{ }

^Q

k

M Φ k

q nr

f

f q

nr f

f



 



 _  ^_

(34)

   

^Q

k k

1 k k

k

Q k

k k

Φ Φ

nr f

q nr

f

q nr

0 f

 

 



 

 

^Q

k k

1 k I

I

nr f

0 q

 



Stern-Volmer egyenlet

(35)

35

M + Q MQ

 

  

     

   

    

   

     

 

^Q ¹

I K I

1 Q

M K M

Q 1 1

M M Q

M

M K M

MQ M

M

Q M K MQ

0 0

0











 



 

 







Statikus kioltás

(36)

Statikus és dinamikus kioltás megkülönböztetése

- τ_F din.-nál változik, stat.-nál nem

(37)

37

Oldószer polaritása és hőmérséklete

(38)

S₀ S₁

Oldószer polaritás

(39)

39

S₀ S₁

vibrációs relaxáció

abszorpció

emisszió

(40)

S₁

vibrációs

relaxáció oldószer relaxáció

abszorpció

emisszió

(41)

41

S₀ S₁

10^-12 s

oldószer relaxáció

10^-10s

abszorpció 10^{-15 s}

emisszió 10^{-9 s}

(42)

S₁

10^-12 s

10^-10s

emisszió 10^{-9 s}

(43)

43

S₀ S₁

10^-12 s

10^-10s

emisszió 10^{-9 s}

(44)

Patman

CH3(CH2)14 C

O

CH3

CH2 CH2N(CH3)3+

(45)

45

Lakowicz, p. 199 Poláris oldószer stabilizálja a gerj.

állapotot

(46)

400 500 I_F

 [nm]

(47)

47

Kettős fluoreszcencia

DMANCN fl. Színképe etilénglikolban Lakowicz, p. 201

(48)

Acrylodan

N

O

H

H H

H3C

CH3

(49)

49

Zsírsavkötő fehérje működésének vizsgálata

Lakowicz, p. 202 Kovalensen kötött „címke”

(50)

DOS

N C (CH2)3CH3

CH3 CH3

O

(51)

51

DOS korrigált fluorszcenciaspektruma ciklohexánban (CH), toluolban (T), etilacetátban (EA), butanolban (Bu), DPPC vezikulákban (----)

Lakowicz, 186. o.

Lokális polaritás vezikulában

(52)

Polaritás hatása: Lippert-egyenlet

+

_

- - - -

+ + + +

2a

_G v. _E

(53)

53

Lippert-egyenlet



_E _G



² _VR

2 2 F 3

A

E

1 n

2 1 n

1 2

1 a

h 2

h      



 







 







 







+

_

- - - -

+ + + +

2a

_G v. _E

(54)

Naftilamin-származékok Stokes eltolódása

(55)

55

CH2 CH NH2

COOH

*

COOH NH2 CH2 CH

HO

*

COOH NH2 CH2 CH

NH

Fluoreszkáló aminosavak

fenil-alanin

tirozin

triptofán

(56)

Triptofán abszorpciós és emissziós spektruma

(víz, pH 7)

(57)

57

Lakowicz p. 453

A triptofán környezetének hatása fehérjék fluoreszcencia spektrumára

1) Apoazurin Pfl 2) T1 ribonuklease 3) staphillococcus

nuclease 4) glucagon

(58)

Rezonancia energia-átadás

(Förster resonance energy transfer = FRET)

Távolságmérés fluoreszcenciával!

Mikroszkóppal a hullámhossztól függő, UV- fénnyel ~ 200 nm-es felbontás érhető el

FRET: 2-10 nm-es távolságok érzékelhetők

(59)

59

Donor festék – akceptor festék, D fluoreszc. tartománya átfed A absz. tartományával.

(60)

Ha D és A távolsága kicsi, FRET, D-t gerjesztve az A fluoreszkál

A hatás 1/r⁶-nal arányos

(61)

61

Példa: DNS –foszfolipid kölcsönhatás vizsgálata

C. Madeira, Biophys. J. 85, 3106 (2003)

(62)

Akceptor

Donor: EtBr

(etidium bromid)

N

C₂H₅

NH₂ H₂N

+

(63)

63

EtBr abszorpció

BODIPY

fluoreszcencia

(64)

Fehérjék konformáció-változását lehet FRET-tel követni

(65)

65

Időfelbontásos

fluoreszcencia-spektroszkópia

(66)

Időkorrelált

egyfoton-számlálás

(67)

67

Fluoreszcencia lecsengési görbe

(68)

Fázismodulációs módszer

Folytonos lézer amplitúdóját szinuszosan moduláljuk.



fluoreszcencia Int.

t

(69)

69

Folytonos lézer Modulátor Minta

Monokromátor PMT

Lock-in

( fázisérzékeny detektor)

Referencia

jel szűrő

Fázismodulációs mérőrendszer

(70)

Oldószer-relaxáció hatása a fl. spektrumra

(71)

71

Festékmolekula orientációs relaxációja

de hd

or

τ τ

τ  

+

_

- - - -

+ + + +

2a

_G v. _E

(72)

Hidrodinamikai súrlódás járuléka

0 M

hd τ

kT fC ηV

τ  

Stokes-Einstein-Debye egyenlet

(73)

73

Dielektromos súrlódás járuléka

 

² ^D

3 2

de τ

1 2ε

1 ε

kT τ a





 

(74)

Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán

Habuchi et al., (Sapporo), Anal. Chem. 73, 366-372 (2001)

Gyanta: sztirol - divinilbenzol kopolimer

Keresztkötések gyakorisága () 8 % divinilbenzol Ioncserélő csoport: Na-szulfonát

(75)

75

Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán

_A [cm^-1]

_F [cm^-1]

_A- _F [cm^-1]

_S1 [ps]

_or [ps]

víz 15 699 14 970 729 380 110

gyanta 15 211 14 925 286 2340 >10 000

(76)

Irodalom

1. J. R. LAKOWICZ, Principles of Fluorescence

Spectroscopy, 2nd Edition, Kluwer Academic, London, 1999 2. C. REICHARDT, Chem. Rev. 94, 2319-2358 (1994)

3. M. KUBINYI, A. GROFCSIK, I. PÁPAI, W. J. JONES, Chem. Phys. 286, 81-96 (2003)

4. S. KULMALA, J. SUOMI, Anal. Chim. Acta 500, 21-69 (2003)

5. F. V. BRIGHT, C. A. MUNSON, Anal. Chim. Acta 500, 71-104 (2003)