Reichardt’s dye

(1)

1

OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA 2011

1.1. Fotodinamikus terápia (VT), szept. 21.

1.2. Fotokróm anyagok (BP), szept. 28.

1.3. Fluoreszcencia-mikroszkópia (VT), okt. 5.

1.4. Festékpróbák az anyagtudományban (KM), okt. 12.

1.5. Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia (KM), okt. 19.

(2)

ALAPISMERETEK

(vizsgára, doktori szigorlatra átismételni)

Kémiai anyagszerkezettan

V. OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA (Optsp05)

VI. A MOLEKULÁK FORGÓMOZGÁSA (Forgo05) VII. A MOLEKULÁK REZGŐMOZGÁSA (Rezgo05)

VIII. A MOLEKULÁK ELEKTRONSZERKEZETE (Molel05)

X. LÉZEREK, LÉZERSPEKTROSZKÓPIAI MÓDSZEREK (Lezer05)

(3)

3

Festékpróbák

Abszorbeáló próbák Fluoreszkáló próbák

(4)

Reichardt’s dye

N Ph Ph

Ph

Ph Ph

O +

_

(5)

5

N Ph Ph

Ph

Ph Ph

O +

_ O

Ph Ph

Ph

N Ph

. .

h

Reichardt’s dye

„charge transfer” festék

C. REICHARDT, Chem. Rev. 94, 2319-2358 (1994)

(6)

A Reichardt-festék abszorpciós színképe 90 %-os (m/m) glicerin-víz

(7)

7

S₀

 = 810 nm Ph-O-Ph

 = 453 nm H₂O

S₁

Oldószer polaritás

(8)

skála

Az oldószer polaritását jellemzi.

N

E

T

   

 

^víz ^E



^TMS



E

TMS E

oldószer E E

T T

T N T

T 

 

(9)

9

Szolvatokromizmus: a szín függ az oldószertől

(10)

Termokromizmus: A szín függ a hőmérséklettől

Etanolban + 78 C _max= 568 nm - 78 C _max= 513 nm

(11)

11

Termokromizmus: A szín függ a hőmérséklettől

Etanolban + 78 C _max= 568 nm - 78 C _max= 513 nm

Piezokromizmus: A szín függ a nyomástól Etanolban  1 bar _max= 547 nm

10 kbar _max= 520 nm

(12)

Festékpróba CD-spektroszkópiai

alkalmazása

(13)

13

Példa biológiai CD vizsgálatra:

DNS vizsgálata akridin naranccsal

N

N N

H

+ AN

Az AN interkalációs komplexet képez

(14)

AN – DNS

rendszerek CD spektruma

a hozzáadott DNS

mennyiség függvényében

c

_AN⁰

 10

^⁵

M

exciton felhasadás

(15)

15

A fluoreszcencia-mérés előnyei az abszorpcióméréssel szemben

1. Nem kell átlátszó minta 2. Nagyobb érzékenység

3. Háromszoros szelektivitás

- gerjesztési hullámhossz szerint - emissziós hullámhossz szerint - lecsengési idő szerint

Hátrány: a vegyületeknek csak kis hányada fluoreszkál

(16)

Fluoreszcens festékpróbák

J. R. LAKOWICZ, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Edition, Kluwer Academic, London, 1999

(17)

17

O N

N N C2H5

C2H5 C2H5

C2H5 +

ClO 4-

Oxazin 1

(18)

0 0,5 1 1,5 2 2,5

200 400 600 800

Hullámhossz (nm)

Abszorbancia

Oxazin 1 UV-látható abszorpciós spektruma

(19)

19

Oxazin1 + receptor

(20)

(21)

21

Spektrofluoriméterek

-stacionárius

- időfelbontásos (_F mérése, időkorrelált egyfoton-számlálás)

(22)

Vázlat

 Műszerek

stacionárius spektrofluoriméter időkorrelált egyfoton-számlálás

Statikus kioltás

 dinamikus kioltás

 oldószer polaritás / hőmérséklet / viszkozitás hatása

 Lippert-egyenlet

 vibrációs relaxáció

 Oldószer relaxáció

 kettős fluoreszcencia

(23)

23

Stacionárius

(24)

Időkorrelált

egyfoton-számlálás

(25)

25

Fluoreszcencia lecsengési görbe

(26)

Statikus kioltás

(27)

27

Oxazin1 + receptor

(28)

(29)

29

(30)

 

  

     

   

    

     

I

Q F K

F

Q Q

F F Q

F

F K F

Q F

F F

Q F

Q K F

Q F

F







 









 







1

0

0 0

0

(31)

31

Dinamikus kioltás

(32)

(33)

33

Lakowicz, p. 461

(34)

M + h

M + 

M + Q M^*

(35)

35

A dezaktiválódás sebessége és fluoreszcencia-hatásfoka

Kioltó nélkül

 

^ ^

 

^ ^

 

^

 k M k M

dt M d

nr f

Kioltóval

 

^k

 

^M ^k

   

^M ^k ^M

^{ }

^Q

dt M d

q nr

f



 







     

f nr f nr

f 0 f

k k

k M

k

M Φ k

 

 _  ^ _

 

^M ^k

   

^M

 

^k ^M

^{ }

^Q ^k ^k ^k ^k

^{ }

^Q

k

M Φ k

q nr

f

f q

nr f

f



 



 _  _ ^ _

(36)

   

^Q

k k

1 k k

k

Q k

k k

Φ Φ

nr f

q nr

f

q nr

0 f

 

 



 

 

^Q

k k

1 k I

I

nr f

q F

F 0

 



Stern-Volmer egyenlet

(37)

37

Oldószer polaritása és hőmérséklete

(38)

S₀ S₁

Oldószer polaritás

(39)

39

S₀ S₁

vibrációs relaxáció

10^-12 s

oldószer relaxáció

10^-10s

abszorpció 10^{-15 s}

emisszió 10^{-9 s}

(40)

Polaritás hatása: Lippert-egyenlet

+

_

- - - -

+ + + +

2a

_G v. _E

(41)

41

Lippert-egyenlet



_E _G



² _VR

2 2 F 3

A

E

1 n

2 1 n

1 2

1 a

h 2

h      



 







 







 







+

_

- - - -

+ + + +

2a

_G v. _E

(42)

Naftilamin-származékok Stokes eltolódása

(43)

43

Prodan

N CH₃

CH₃ CH₂

CH₃

O

CH₂ CH₃

O^-

N CH₃

CH₃

h

+

Lakowicz, p. 200

Ikerionos gerjesztett állapot, spektrum eltolódás a polaritás függvényében

(44)

Patman

CH3(CH2)14 C

O

CH3

CH2 CH2N(CH3)3+

(45)

45

Lakowicz, p. 199

(46)

400 500 I_F

 [nm]

Lakowicz, p. 199

(47)

47

Kettős fluoreszcencia

DMANCN fl. Színképe etilénglikolban Lakowicz, p. 201

(48)

Acrylodan

N

O

H

H H

H3C

CH3

Hidrofób festék, zsírsav-megkötő

(49)

49

Zsírsavkötő fehérje működésének vizsgálata

Lakowicz, p. 202 FABP = fatty acid binding protein Titrálás zsírsavval (oleát)

(50)

CH2 CH NH2

COOH

*

COOH NH2 CH2 CH

HO

* NH2 CH2 CH

Fluoreszkáló aminosavak

fenil-alanin

tirozin

triptofán

(51)

51

Triptofán abszorpciós és emissziós spektruma

(víz, pH 7) Lakowicz, p. 446

(52)

A triptofán környezetének hatása fehérjék fluoreszcencia spektrumára

1) Apoazurin Pfl 2) T1 ribonuklease 3) staphillococcus

(53)

53

Rezonancia energia-átadás

(Förster resonance energy transfer = FRET)

Távolságmérés fluoreszcenciával!

Mikroszkóppal a hullámhossztól függő, UV- fénnyel ~ 200 nm-es felbontás érhető el

FRET: 2-10 nm-es távolságok érzékelhetők

(54)

Donor festék – akceptor festék, D fluoreszc. tartománya átfed A absz. tartományával.

(55)

55

Ha D és A távolsága kicsi, FRET, D-t gerjesztve az A fluoreszkál

A hatás 1/r⁶-nal arányos

(56)

Példa: DNS –foszfolipid kölcsönhatás vizsgálata

(57)

57

Akceptor

Donor: EtBr

(etidium bromid)

N

C₂H₅

NH₂ H₂N

+

Br-

(58)

EtBr abszorpció

BODIPY

fluoreszcencia

(59)

59

Fehérjék konformáció-változását lehet FRET-tel követni

(60)

(61)

61

Festékmolekula orientációs relaxációja

de hd

or

τ τ

τ  

+

_

- - - -

+ + + +

2a

_G v. _E

(62)

Hidrodinamikai súrlódás járuléka

0 M

hd τ

kT fC ηV

τ  

Stokes-Einstein-Debye egyenlet

(63)

63

Dielektromos súrlódás járuléka

 

² ^D

3 2

de τ

1 2ε

1 ε

kT τ a





 

(64)

Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán

Habuchi et al., (Sapporo), Anal. Chem. 73, 366-372 (2001)

Gyanta: sztirol - divinilbenzol kopolimer

Keresztkötések gyakorisága () 8 % divinilbenzol Ioncserélő csoport: Na-szulfonát

(65)

65

Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán

_A [cm^-1]

_F [cm^-1]

_A- _F [cm^-1]

_S1 [ps]

_or [ps]

víz 15 699 14 970 729 380 110

gyanta 15 211 14 925 286 2340 >10 000