Klinikai tanulmányok, klinikai minták
Retrospektív vizsgálatokat a laboratórium rutin diagnosztikai tevékenysége során gyűjtött klinikai mintákra alapoztunk. A klinikai adatbázisból gyűjtöttük össze a betegadatokat. A betegadatok és HPV paraméterek összefüggését keresztmetszeti, eset-kontroll (IL-10 polimorfizmus, IL-10 promoter metiláció) vagy longitudinális (HPV onkogén kockázata a fertőzés természetes lefolyása során és a műtéti eltávolítás után) módon értékeltük. amelyeket a folyamat kimeneteléig követtük. A periodontitis és az otosclerosis projektekben prospektív minta- és adatgyűjtést végeztünk és az összefüggéseket keresztmetszeti, eset-kontroll módon értékeltük. A HPV vizsgálatokban exfoliált hámsejteket, a periodontitis vizsgálatokban a periapikális granulomákat és impaktált bölcsességfogakat, az otosclerosis vizsgálatokban, stapes és kortikális csontmintákat gyűjtöttünk. A gyökércsúcsi szövetszaporulatot RNAlater reagensben, az impaktálódás miatt eltávolított, önmagukban ép bölcsességfogakat steril fóliában, az otosclerosisos mintákat steril Eppendorf csőben gyűjtöttük és -70 °C alatt tároltuk a feltárásig.
Primer sejtek, folyamatos sejtvonalak
Folyamatos cervix carcinoma eredetű sejtvonalakat (HeLa, SiHa, Caski, HT-3, C33A) és az epiteliális eredetű immortalizált HaCaT sejtvonalat DMEM alapú tápfolyadékban tenyésztettünk. A primer humán keratinocitákat szérummentes DM-SFM tápfolyadékban tenyésztettük, akárcsak az LXSN retrovírus vektorba illesztett HPV-16 E6 és E7 onkogénekkel transzdukált keratinocita kultúrákat [200]. A korai passzázsban szaporodó, proliferálódó állapot mellett a differenciálódás hatását is vizsgáltuk, amelyet 1,8 mM-lal megemelt CaCl2 koncentráció mellett és 10% borjúszérummal kiegészített DMEM tápfolyadékkal értünk el [200]. Perifériás mononukleáris sejteket (PBMC) vénás vérből izoláltuk Hypaque-Ficoll gradiens centrifugálással.
Nukleinsav feltárás, cDNS előállítás
A sejtvonalakból fenol-kloroformos módszerrel tártuk fel a DNS tartalmat és trizol alkalmazásával az RNS-t. Az alkalikus Hybrid Capture transzport közegbe vett exfoliált hámsejteket ecetsav-alkoholos kicsapással izoláltuk, míg a fiziológiás só alapú transzport közegbe vett exfoliált hámsejteket szilikamembrános izolálással (Roche, Viral Nucleic Acid Kit). Az izolált DNS 5 ug aliquotjainak nátrium-biszulfitos modifikálását a következő elegyben végeztük: 100 ul desztvíz, 11 ul 3M NaOH, 60 ul hidrokinon, 1000 ul 3,6 M nátrium-biszulfit. 16 óra 55 °C inkubálás után GeneClean Kittel (Qiagen) nyertük vissza a modifikált DNS-t . A bölcsességfog mintákat a steril fóliában fémkalapáccsal törtük össze, majd a törmelékből a pulpaszövetet steril fogászati gyökérkezelő műszerekkel és csipeszekkel távolítottuk el. A biopszia jellegű mintákat (pulpa, szövet, periapikális granuloma, csontminták a
fülből) folyékony nitrogén segítségével porcelánmozsárban homogenizáltuk. A homogenizált mintákból az RNS-t trizol alkalmazásával, a DNS-t szilikamembrános izolálással (Roche, Viral Nucleic Acid Kit) tártuk fel. A RNS-ről cDNS kópia szintéziséhez Enhanced Avian HS (Sigma-Aldrich), High Capacity cDNA (Life Technologies) reverz transzkriptáz vagy rTth enzimet használtunk. Az utóbbi a cDNS PCR amplifikálására is alkalmas volt.
DNS, cDNS, biszulfit modifikált DNS PCR amplifikálása
A célszekvenciákra tervezett oligonukleotid primerek segítségével amplifikáltuk a kiválasztott genomi szakaszokat, a primerekre optimalizált hőmérséklet profillal. Allél-specifikus PCR vizsgálatban külön amplifikációs reakcióban alkalmaztuk az egyik primer két különböző variánsát, amelyek a 3’ utolsó nukleotidban különböztek az allélt meghatározó egyedi nukleotid típusú polimorfizmusnak megfelelően. Az amplifikációt Taq polimeráz enzimmel végeztük. A vizsgált minta alkalmasságát PCR amplifikációra háztartási gének (béta-globin, GAPDH, RPLP2) amplifkációjával ellenőriztük.
Kétlépcsős (nested) PCR alkalmaztunk, amikor a vizsgált célszekvenciát jelenléte alacsony kópiaszámban volt várható. A konvencionális végpontos PCR amplifikáció eredményét agaróz gélelektroforézis segítségével vizualizáltuk és a molekulaméret alapján azonosítottuk. További azonosítást biztosított a PCR termék restrikciós fragmenthossz analízise és a szekvenálása a Sanger módszer alapján. A célszekvencia vagy a cDNS mennyiségi meghatározását valós idejű detektálással, SYBR Green PCR Mastermix vagy TaqMan PCR Mastermix (Life Technologies) polimerázzal ABI Prism 7500 PCR készülékben végeztük. A TaqMan polimerázhoz a célszekvenciára tervezett primer-próba mixeket (Life Technologies) használtuk. Adott szekvencia relatív mennyiségét CT módszerrel fejeztük ki. Populációk közötti összehasonlítást CT módszerrel végeztünk, minden egyes mintában meghatároztuk a célszekvencia és a háztartási gén CT értékének különbségét, majd ezen DCT értékek eloszlását, medián értékét hasonlítottuk össze a különböző csoportok között.
Klónozás plazmidvektorokba és transzfektálás eukarióta sejtbe
A PCR termékek klónozását plazmidvektorba T/A ligálással végeztük. A Taq polimeráz 3’ túlnyúló adenint szintetizál a PCR termékek végére. A plazmidot olyan restrikciós enzimmel hasítottuk, amelyik tompavéget eredményez, majd Go Taq polimerázzal (Promega) 3’ túlnyúló timin illesztettünk a tompavégekre. A vektor és az inszert így egymáshoz kompatibilis ragadós véget kapott, amelyek révén T4 DNS ligázzal kovalensen egymáshoz ligáltuk őket. A ligálási terméket E. coli baktériumba transzformáltuk és felszaporítottuk, majd kiválasztottunk egy olyan klónt, amelyik a tervezett módon hordozta az inszert szekvenciát. A klón a rekombináns plazmiddal együtt felszaporítottuk, majd nagy mennyiségben visszaizoláltuk a rekombináns plazmidot.
Az epiteliális eukarióta sejtvonalakat sejttenyésztő Petri-csészében tenyésztettük és a rekombináns plazmidot 10 ug mennyiségben transzfektáltuk Lipofectamin 2000 (Invitrogen) reagens
alkalmazásával. 48 órával később a rekombináns plazmid aktivitását luciferáz teszt (Luciferase Assay, Promega) alkalmazásával mértük.
Fehérje izolálás, Western-blot, array-blot
Sejttenyészeteket ill. transzfektált sejttenyészeteket tripszinnel választottunk fel a tenyésztőflaskák aljáról. A teljes fehérjetartalmat proteáz gátló (Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail, Roche) és foszfatáz gátló 1mM NaF jelenlétében lízis pufferben vettük fel (150mM NaCl, 1%v/v NP-40, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) 0,5%w/v Na-dezoxikolát, 0,1%w/v SDS, 0,01 %w/v Na-azid, 1 mM EDTA). 15 perc 4°C-os inkubálás után 15 perc 13000 g 4°C-os centrifugálás után a fehérjetartalmú felülúszót használtuk.
A felülúszókat Laemmli pufferrel denaturáltuk 95°C-on 5 percig, majd 10 % SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel molekulaméret alapján szétválasztottuk és a kialakult molekula eloszlást nitrocellulóz membránra vittük át elektromos térerő segítségével. A membrán aspecifikus fehérjekötését 3% BSA oldattal blokkoltuk, majd az elsődleges antitestekkel és a következő lépésben tormaperoxidázzal jelölt másodlagos antitestekkel reagáltattuk. Az egyes lépések között 3x 10 perc mosást végeztünk PBS-0,05% Tween20 oldattal. Az immunreakciók eredményeként kialakuló kemilumineszcens (Super Signal West Dura Chemiluminescent Substrate, Pierce) sávokat mutattuk ki röntgen filmen detektálva.
Az Src kináz család egyedi foszforilációs vizsgálatára Human Phophokinase Array Kit-et (Proteome Profiler Array, R&D Systems) alkalmaztuk, amely szendvics rendszerű detektálást biztosít. Az egyes pozíciókba lekötődött foszforilált fehérjéket kemilumineszcens detektálással (l. fentebb) mutattuk ki és denzitometriás méréssel határoztuk meg az egyes foltreakciók intenzitását.
Statisztikai analízis
A statisztikai analízist a klinikai tanulmányokban nem parametrikus statisztikai módszerekkel végeztük, a keresztmetszeti elemzéseket Yates korrigált khi-négyzet, Fisher exact statisztikákkal ill.
egy- és több változós logisztikus regressziós módszerrel esélyhányados (odds ratio) és a hozzátartozó 95% megbízhatósági tartomány meghatározásával végeztük. Folyamatos, nem normál eloszlású változók eloszlását non-parametrikus Mann-Whitney teszttel hasonlítottuk össze. A longitudinális elemzéseket egy- és több változós Cox regressziós módszerrel relatív kockázat és a hozzátartozó 95%
megbízhatósági tartomány meghatározásával végeztük. Az in vitro kísérletes munkában mérési adat szórását, standard hibáját határoztuk meg, valamint T-próbával vizsgáltuk a szignifikanciát.